[發明專利]一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備方法

有效

• 申請號: 201611174860.2
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106718908B
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 石先陽;郜庭;葉成達
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 李啟勝

本發明公開了一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備方法，其特征在于以蘆葦種子為外植體；消毒后置于誘導培養基上誘導出胚性愈傷組織；然后獲取胚性培養物生成完整植株；得到再生蘆葦苗；將蘆葦再生苗轉至無菌組培瓶中加入OECD模擬廢水、活性污泥孵育，取根組織消毒研磨，再將漿稀釋涂布于MS平板上培養，收集菌體，清洗后制成細菌重懸液，取蘆葦胚性培養物浸入細菌重懸液中孵育，再將蘆葦胚性培養物進行培養。配制溶膠懸液和CaCl₂溶液，將蘆葦胚性培養物加入種皮基質中，再用無菌巴氏吸管每次吸入一個蘆葦胚性培養物，滴入CaCl₂溶液中，取出后清洗晾干，形成人工種子；該方法制備人工種子具有耐鎘、提高種子活力和幼苗品質等優點，適合大規模推廣。

技術領域

本發明涉及無性繁殖領域，具體為一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備。

背景技術

蘆葦是廣泛分布于世界各地、形態上高度分化的草甸與濕地植被建群種，具有重要的生態學和經濟學價值。蘆葦在自然環境中以根狀莖繁殖為主，難以進行種子繁殖。長期大量的分株繁殖常常會導致種性的退化，從而影響植物的生活力。同時由于人類活動對生態環境的嚴重干擾，部分濕地重金屬污染程度不容樂觀。長期處于重金屬污染環境中，植物的根莖存活和繁殖往往受到抑制，而導致種群衰退。所以，避免從蘆葦原生地采取蘆葦而保護原生地生態環境的同時，又如何輕便、快速培育具有重金屬耐受性的幼苗，成為恢復蘆葦種群研究的瓶頸。

植物可通過有性的和無性的兩個生命發育周期來繁殖，對于很難以種子進行有性繁殖的植物種，由微膠囊包埋植物繁殖體制備而成的人工種子，可替代天然種子進行無性繁殖。常規的人工種子研制一直都是建立在植物單獨存在的理念之上，即通過離體組織培養產生體細胞胚或不定芽等作為包埋繁殖體，而以植物和微生物共生體為培育材料的研究很少。植物離體組織培養一般建立和維持在無菌條件下，以降低微生物污染物對體外培養的植物材料做有害競爭。而有著生態獨特性的植物內生細菌，不僅能和宿主植物協同進化，并能產生具有生物活性的代謝產物而提高植物對生物脅迫或非生物脅迫的抵抗能力。因而引入特定功能的內生細菌來增強人工種子活力和品質，將具有改良植物表型的潛力；因此本發明在離體培養條件下，制備一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子。

發明內容

本發明的目的在于提供一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：步驟如下：

步驟一：采集成熟蘆葦小穗，去內外稃，以表面無損的蘆葦種子為外植體；

步驟二：將步驟一中所述的外植體消毒后，置于誘導培養基上誘導出粘性愈傷組織；

步驟三：剝取步驟二中所述的粘性愈傷組織，將所述粘性愈傷組織轉置于新鮮的誘導培養基上，進一步誘導出胚性愈傷組織；

步驟四：將步驟三所述的胚性愈傷組織通過增殖培養，獲取胚性培養物；

步驟五：將步驟四所述的胚性培養物轉至無植物生長調節劑的再生培養基上生成完整植株；

步驟六：將步驟五中生成的完整植株進行培養，得到蘆葦再生苗；

步驟七：將步驟六所述的蘆葦再生苗轉至無菌組培瓶中進行培養，向所述無菌組培瓶中加入無菌OECD模擬廢水；采集活性污泥，將所述活性污泥離心、清洗后加入所述組培瓶中，用組培膜覆蓋瓶口，將所述組培瓶于人工氣候箱中孵育；

步驟八：取經步驟七處理的蘆葦再生苗的根組織，將所述根組織的表面進行消毒后研磨成漿，再將所述根組織的漿標準稀釋涂布于MS平板上，將所述MS平板放置在恒溫培養箱中培養，待菌落長出；