[發明專利]一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備方法

有效

• 申請號: 201611174860.2
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106718908B
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 石先陽;郜庭;葉成達
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 李啟勝

1.一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟一：采集成熟蘆葦小穗，去內外稃，以表面無損的蘆葦種子為外植體；

步驟二：將步驟一中所述的外植體消毒后，置于誘導培養基上誘導出粘性愈傷組織；

步驟三：剝取步驟二中所述的粘性愈傷組織，將所述粘性愈傷組織轉置于新鮮的誘導培養基上，進一步誘導出胚性愈傷組織；

步驟四：將步驟三所述的胚性愈傷組織通過增殖培養，獲取胚性培養物；

步驟五：將步驟四所述的胚性培養物轉至無植物生長調節劑的再生培養基上生成完整植株；

步驟六：將步驟五中生成的完整植株進行培養，得到蘆葦再生苗；

步驟七：將步驟六所述的蘆葦再生苗轉至無菌組培瓶中進行培養，向所述無菌組培瓶中加入無菌OECD模擬廢水；采集活性污泥，將所述活性污泥離心、清洗后加入所述組培瓶中，用組培膜覆蓋瓶口，將所述組培瓶于人工氣候箱中孵育；

步驟八：取經步驟七處理的蘆葦再生苗的根組織，將所述根組織的表面進行消毒后研磨成漿，再將所述根組織的漿標準稀釋涂布于MS平板上，將所述MS平板放置在恒溫培養箱中培養，待菌落長出；

步驟九：從步驟八所述的MS平板上挑選草螺菌單菌落，接種至NB液體培養基中培養；然后離心處理所述NB液體培養基以收集菌體，清洗收集的所述菌體，使用MS液體培養基重新懸浮所述菌體制成細菌重懸液，調節所述細菌重懸液中草螺菌的OD_600nm值為0.01-1；取至少一個蘆葦胚性培養物浸入所述細菌重懸液中孵育，將所述蘆葦胚性培養物轉至無菌濾紙上除去表面菌體后，再將所述蘆葦胚性培養物置于MS平板上進行培養；

步驟十：配制人工胚乳；向所述人工胚乳溶液中加入海藻酸鈉，配制成溶膠懸液作為種皮基質，同時使用去離子水配制CaCl₂溶液作為絡合劑，將所述溶膠懸液和CaCl₂溶液分別調節pH值后滅菌處理；

步驟十一：將步驟九所述的蘆葦胚性培養物加入步驟十所述的種皮基質中，均勻混合后，再用無菌巴氏吸管每次吸入一個所述蘆葦胚性培養物，滴入步驟十所述的CaCl₂溶液中，取出后將所述蘆葦胚性培養物清洗晾干，即形成人工種子；

步驟十二：將步驟十一所述的人工種子放在MS培養基上進行萌發培養。

2.根據權利要求1所述的一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備方法，其特征在于：所述誘導培養基的制備方法為：向每升MS液體培養基中加入1mg的二氯苯氧乙酸、1mg的萘乙酸、0.5mg的6-芐基腺嘌呤、30g的蔗糖以及0.5mg L-谷氨酰胺；所述增殖培養基的配制方法為向每升MS液體培養基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的瓊脂；所述再生培養基的配置方法為：向每升MS液體培養基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的瓊脂。

3.根據權利要求1所述的一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備方法，其特征在于：步驟二所述的消毒為用質量濃度為5％的次氯酸鈉進行表面消毒，步驟二所述的粘性愈傷組織為在胚芽鞘末端的白色、半透明、有光澤組織；步驟三所述的胚性愈傷組織為表面具有細小瘤狀物和綠點的組織；步驟四所述的胚性愈傷組織通過質量濃度為2.5mg L^-1的2,4-二氯苯氧乙酸進行增殖培養。

4.根據權利要求1所述的一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備方法，其特征在于：步驟六所述的完整植株的高度為5cm～10cm，培養方式為轉至1/2MS液體培養基中進行水培，或以蛭石為栽培基質進行。