[發明專利]一種煙草花葉病毒屬病毒通用檢測引物及其方法

有效

• 申請號: 201611174200.4
• 申請日: 2016-12-19
• 公開（公告）號: CN107058611B
• 公開（公告）日: 2020-02-04
• 發明（設計）人: 李凡;李月月;譚冠林;肖龍;馬龑;熊鋒;蘭平秀;陳小姣;何英云;譚松濤
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/94
• 代理公司: 11453 北京名華博信知識產權代理有限公司
• 代理人: 李中強

1.一種煙草花葉病毒屬病毒通用檢測引物，其特征在于：所述的煙草花葉病毒屬病毒通用檢測引物為：

正向引物TobamodF：5’-TKGAYGGNGTBCCNGGNTGYGG-3’，

反向引物TobamodR：5’-ACNGAVTBNABCTGTAATTGCTAT-3’；

所述的檢測引物中N可以是A、C、G、T四種堿基中的任意一種，K為G和T中的一種，Y為C和T中的一種，B為C、G、T中的一種，V為A、C、G中的一種。

2.根據權利要求1所述的一種煙草花葉病毒屬病毒通用檢測引物，其特征在于：所述檢測引物對TMGMV擴增出871bp的產物，對PMMoV擴增出877bp的產物，對TMV、ToMV、ToMMV擴增出880bp的產物，對ORSV擴增出889bp的產物，對CGMMV擴增出874bp的產物。

3.一種煙草花葉病毒屬病毒通用檢測方法，其特征在于：利用權利要求1所述的煙草花葉病毒屬病毒通用檢測引物進行檢測，包括以下具體步驟：

RT反應體系：反轉錄試劑盒為PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit或 TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV RNase H^- Kit，反應體系的總體積為10μL；PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit具體方法為，將含1-2μL的模板，0.5μL煙草花葉病毒屬病毒通用檢測引物反向引物，0.5μL 10mmol/L的dNTP mix，2-3μL ddH₂O的混合液，混勻后65℃反應5min，反應結束迅速放冰上冷卻，之后加入含2μL的5×Primer Script Buffer，0.25μL 40U/μL的RNase Inhibitor，0.5μL 200U/μL的Primer Script RTase，2.25μL ddH₂O的混合液，之后45℃反應1h，70℃反應15min終止反應；

TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV RNase H^- Kit的具體方法為，將含2μL模板，1μL煙草花葉病毒屬病毒通用檢測引物反向引物，3μL ddH₂O的混合樣混勻后，70℃下反應10min，迅速拿出放在冰上冷卻3min，之后加入含2μL 5×M-MLV Buffer，0.5μL 10mM的dNTPmix，0.5μL RTase M-MLV，1μL ddH₂O的混合液，在42℃反應1h，70℃下15min反應結束；

PCR反應體系：PCR擴增試劑盒為2×Es Taq MasterMix，反應體系的總體積為10μL，含5μL 2×Es Taq MasterMix，1μL cDNA模板，0.2-0.4μL煙草花葉病毒屬病毒通用檢測引物正向引物，0.2-0.4μL煙草花葉病毒屬通用引物反向引物， 3.2-3.6μL ddH₂O；

反應程序：94℃預變性2min；94℃變性30s，45-55℃退火30s，72℃延伸0.5-1min，循環30-35次；72℃延伸5-10min；4℃終止反應；

反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察結果。