[發明專利]越橘植物種質的超低溫保存方法

有效

• 申請號: 201611172859.6
• 申請日: 2016-12-18
• 公開（公告）號: CN106818714B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張志東;孫海悅;劉海廣;唐雪東;李亞東;汪立宇
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

本發明公開了越橘莖尖小滴玻璃化超低溫保存的方法，是一種長期安全、穩定可靠、簡單有效的保存越橘優良種質資源的方法，本發明以頂芽莖尖為超低溫保存材料，一方面取材方便，另一方面由于莖尖含有莖尖分生組織，細胞再生能力較強，遺傳穩定性高；超低溫保存后越橘莖尖成活率高達100％，莖尖再生率為91.7％。

技術領域

本發明涉及植物種質資源保存領域，具體地說，種越橘植物種質的超低溫保存方法和超低溫保存越橘植物種質恢復培養的方法。

背景技術

越橘屬于杜鵑花科( Ericaceae )越橘屬( Vaccinium spp .)植物，為多年生落葉或常綠灌木或小灌木樹種。全世界越橘屬植物約有400個種，我國約有91個種、28個變種，分布于我國東北和西南地區。果實富含花色苷等抗氧化物質，具有改善視力、抗氧化、抗癌及延緩腦神經衰老等保健功能，被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一，同時也被譽為“漿果之王”。

種質資源保存是越橘育種和保持遺傳多樣性的重要保證，培育高產、優質和高抗新品種離不開豐富的種質資源，因此開展越橘種質資源的保存具有重要的意義。

目前有關越橘種質資源的保存方法的研究較少，主要集中在原地栽培、遷地栽培以及種子庫保存，但原地和遷地栽培管理和取材需要大量的人力、物力，且保存的種質資源占地面積大，易受到病蟲害和自然條件的影響。隨著生物技術的發展，基于利用植物組織培養技術對越橘種質資源進行保存的研究僅局限于在實驗室中對研究材料的保存。一方面保存過程繁瑣、費時費力，成本較高；另一方面，隨著保存時間的延長和繼代次數的增加，保存的材料易受到污染的干擾。

超低溫保存技術是20世紀70年代在低溫保存的基礎上發展起來的一門新興技術。超低溫保存通常以液氮( -196℃)為冷源，生物材料保存在如此低溫條件下，活細胞內的代謝活動幾乎完全停止，因而可使生物材料在該溫度下不會發生遺傳性狀的改變，且保存過程中細胞的活力及形態發生的全能性不受影響。因其具有操作簡單，可保存時間長，占用空間小且不受病蟲害的干擾等優點，是目前公認的長期而穩定的保存植物種質資源的理想方法。現已開發出多種超低溫保存的方法，然而針對不同物種甚至對于同一物種的不同品種，其適宜的超低溫保存方法及程序技術都有可能不同。目前有關利用超低溫保存技術對越橘種質資源進行保存的研究尚未見報道。

發明內容

本發明的目的是針對越橘現有保存技術中的不足，提供了越橘莖尖小滴玻璃化超低溫保存的方法和超低溫保存越橘植物種質恢復培養的方法。

越橘植物種質的超低溫保存方法，它包括

1）煉苗：選取4周苗齡的組培苗，取0.4-0.6 cm帶有頂芽的莖段接種到WPM培養基上4℃暗處理2—4周；

2）越橘莖尖剝取：在無菌條件下，在體視顯微鏡下剝取煉苗后的頂芽，莖尖長為1.5—2.0mm；

3）預培養：將剝取的莖尖接種于添加有0.3M蔗糖的WPM固體培養基上，于組培室黑暗培養18—30h；

4）裝載：將預培養后的離體莖尖轉接于裝載液中，于室溫下裝載處理20-40min；

5）玻璃化處理：將裝載處理后的莖尖轉接于PVS2溶液中，于0℃處理30-50min；

6）小液滴制作：將PVS2處理后的莖尖轉移到錫箔條上 ,并向每個莖尖滴加6μLPVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2小液滴中，每個錫箔條上放9-11個莖尖；

7）超低溫冷凍保存：將上述制作好的含有小液滴的錫箔條直接浸入液氮中進行冷凍，然后將冷凍后的錫箔條置于冷凍離心管中，蓋緊蓋子后，投入液氮中保存；

步驟1) 所述的的煉苗時間為3周，步驟3)所述的預培養時間為24h；

步驟4）中所述的裝載液的組成為：WPM+2M甘油+1.0M蔗糖，裝載時間為30min；