[發明專利]越橘植物種質的超低溫保存方法

有效

• 申請號: 201611172859.6
• 申請日: 2016-12-18
• 公開（公告）號: CN106818714B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張志東;孫海悅;劉海廣;唐雪東;李亞東;汪立宇
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

1.一種超低溫保存越橘植物種質及恢復培養的方法，其特征在于，它包括：

1）煉苗：選取4周苗齡的組培苗，取0.4-0.6 cm帶有頂芽的莖段接種到WPM培養基上4℃暗處理2—4周；

2）越橘莖尖剝取：在無菌條件下，在體視顯微鏡下剝取煉苗后的頂芽，莖尖長為1.5—2.0mm；

3）預培養：將剝取的莖尖接種于添加有0.3M蔗糖的WPM固體培養基上，于組培室黑暗培養18—30h；

4）裝載：將預培養后的離體莖尖轉接于裝載液中，于室溫下裝載處理20-40min；

5）玻璃化處理：將裝載處理后的莖尖轉接于PVS2溶液中，于0℃處理30-50min；

6）小液滴制作：將PVS2處理后的莖尖轉移到錫箔條上 ,并向每個莖尖滴加6μL PVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2小液滴中，每個錫箔條上放9-11個莖尖；

7）超低溫冷凍保存：將上述制作好的含有小液滴的錫箔條直接浸入液氮中進行冷凍，然后將冷凍后的錫箔條置于冷凍離心管中，蓋緊蓋子后，投入液氮中保存；

步驟1) 所述的煉苗時間為3周，步驟3)所述的預培養時間為24h；

步驟4）中所述的裝載液的組成為：WPM+2M甘油+1.0M蔗糖，裝載時間為30min；

步驟5）所述的PVS2溶液的組成為：WPM+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亞砜+0.4M蔗糖；處理時間為40min；

8）卸載：將步驟7）所述的超低溫冷凍保存的離體莖尖取出，放置于卸載液中進行解凍和卸載；所述的卸載液的組分為：WPM+1.2M蔗糖；卸載條件為：室溫下卸載20min；

9）恢復培養：將卸載處理后的離體莖尖用無菌濾紙吸干表面殘留液，轉接于恢復培養基中進行恢復培養；恢復培養基為WPM+0.3mg/L ZT +3％蔗糖+0.7％瓊脂，pH＝5.8；恢復培養條件為：組培室黑暗培養 1d，最后轉至正常光照條件下進行培養。