[發(fā)明專利]一種外周血淋巴細(xì)胞連接蛋白43與IL?2和IL?6表達(dá)的相關(guān)性分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611167672.7
• 申請(qǐng)日: 2016-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN106596916B
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬克濤;李新芝;司軍強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 石河子大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;G01N33/535;G01N33/68;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種外周血淋巴細(xì)胞連接蛋白43與IL-2和IL-6表達(dá)的相關(guān)性分析方法，具體地說，涉及一種自發(fā)性高血壓大鼠外周血淋巴細(xì)胞連接蛋白43與IL-2和IL-6表達(dá)的相關(guān)性分析方法。

背景技術(shù)

高血壓作為多因素引起的慢性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。ARIMA等研究發(fā)現(xiàn)，高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病均與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能關(guān)系密切。免疫系統(tǒng)，尤其外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞中均表達(dá)連接蛋白(connexin,Cx)。Cx是縫隙連接的基本組成單位，在相鄰細(xì)胞間傳遞信息物質(zhì)，構(gòu)成縫隙連接細(xì)胞間通訊。MATSUE等研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖和腫瘤壞死因子ɑ刺激下，單核細(xì)胞中Cx43表達(dá)可顯著上調(diào)。因此，縫隙連接與機(jī)體免疫炎性反應(yīng)相關(guān)，參與免疫系統(tǒng)細(xì)胞間通訊。CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞作為外周血T細(xì)胞的主要亞群細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎性反應(yīng)，在抗感染、抗腫瘤方面發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種外周血淋巴細(xì)胞連接蛋白43與IL-2和IL-6表達(dá)的相關(guān)性分析方法，初步探討Cx43與高血壓大鼠炎性反應(yīng)間的關(guān)系，為闡明Cx43對(duì)高血壓患者炎性反應(yīng)的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

其具體技術(shù)方案為：

一種外周血淋巴細(xì)胞連接蛋白43與IL-2和IL-6表達(dá)的相關(guān)性分析方法，包括以下步驟：

步驟1、大鼠血壓測(cè)定 應(yīng)用BP-6無創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)儀測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓，避免大鼠躁動(dòng)，于大鼠清醒安靜狀態(tài)下連續(xù)測(cè)量3次，每次間隔至少1min，取測(cè)量3次平均值即為大鼠收縮壓。

步驟2、樣本采集 3％戊巴比妥鈉麻醉大鼠，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集腹主動(dòng)脈外周血5ml，1 500r/min離心5min，取血漿于-20℃保存，離心后的下層血細(xì)胞用于分離外周血淋巴細(xì)胞。

步驟3、炎性因子IL-2和IL-6表達(dá) 取凍存于-20℃的血漿樣品，ELISA法檢測(cè)IL-2和IL-6表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

步驟4、淋巴細(xì)胞分離 將血細(xì)胞與0.9％氯化鈉溶液1:1等體積稀釋，吹打混勻。取無菌15ml離心管，加入淋巴細(xì)胞分離液，將細(xì)胞懸液緩慢按照1:1比例加到淋巴細(xì)胞分離液上層，保證血液置于淋巴細(xì)胞分離液上層。根據(jù)密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，低速離心機(jī)水平離心30min(1 500r/min，緩升緩降)。將分離的白色渾濁淋巴細(xì)胞層吸出至無菌15ml離心管內(nèi)，加入3倍0.9％氯化鈉溶液洗滌，以1 800r/min離心6min洗滌2次，棄上清，沉淀即淋巴細(xì)胞。加入1ml培養(yǎng)基重懸，吸取50μl到1.5ml離心管，加450μl磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋10倍，顯微鏡下計(jì)數(shù)并用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活性。細(xì)胞活性為95％以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶個(gè)/ml，將細(xì)胞接種在24孔板中。

步驟5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD₄⁺和CD₈⁺T細(xì)胞Cx43表達(dá) 收集5×10⁵個(gè)細(xì)胞于EP管內(nèi)，100μl PBS重懸細(xì)胞，分別加入相應(yīng)流式抗體(CD₄-APC，APC同型對(duì)照；CD₈-PE，PE同型對(duì)照)1μl，并設(shè)立陰性對(duì)照。125μl固定劑固定淋巴細(xì)胞，4℃孵育20min，Cx43一抗1μl抗體與99μl 1×破膜劑破膜，37℃孵育20min；FITC二抗1μl，37℃孵育20min；1ml 1×破膜劑洗滌，棄上清液，PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，流式CELLQuest軟件進(jìn)行分析。

步驟6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-2mRNA和IL-6mRNA表達(dá) 計(jì)數(shù)分離出的淋巴細(xì)胞，調(diào)整培養(yǎng)基至細(xì)胞濃度為1×10⁶個(gè)/ml。將淋巴細(xì)胞分為空白對(duì)照組、刀豆蛋白(Concanavalin A，ConA)組(培養(yǎng)48h后加入5μg/ml ConA)和Gap27+ConA組(培養(yǎng)前加入5 00μmol/L Gap275，培養(yǎng)48h后加入5μg/ml ConA)。加入10％自體血清(血清處理步驟：56℃滅活30min，以4 000r/min離心30min，4℃保存)，于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。