[發明專利]一種外周血淋巴細胞連接蛋白43與IL?2和IL?6表達的相關性分析方法

有效

• 申請號: 201611167672.7
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106596916B
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 馬克濤;李新芝;司軍強
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/535;G01N33/68;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種外周血淋巴細胞連接蛋白43與IL-2和IL-6表達的相關性分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、大鼠血壓測定

應用BP-6無創血壓監測儀測量大鼠尾動脈血壓，避免大鼠躁動，于大鼠清醒安靜狀態下連續測量3次，每次間隔至少1min，取測量3次平均值即為大鼠收縮壓；

步驟2、樣本采集

3％戊巴比妥鈉麻醉大鼠，乙二胺四乙酸抗凝管采集腹主動脈外周血5ml，1 500r/min離心5min，取血漿于-20℃保存，離心后的下層血細胞用于分離外周血淋巴細胞；

步驟3、炎性因子IL-2和IL-6表達

取凍存于-20℃的血漿樣品，ELISA法檢測IL-2和IL-6表達水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行；

步驟4、淋巴細胞分離

將血細胞與0.9％氯化鈉溶液1:1等體積稀釋，吹打混勻；取無菌15ml離心管，加入淋巴細胞分離液，將細胞懸液緩慢按照1:1比例加到淋巴細胞分離液上層，保證血液置于淋巴細胞分離液上層；根據密度梯度離心法分離淋巴細胞，低速離心機水平離心30min，1 500r/min，緩升緩降；將分離的白色渾濁淋巴細胞層吸出至無菌15ml離心管內，加入3倍0.9％氯化鈉溶液洗滌，以1 800r/min離心6min；洗滌2次，棄上清，沉淀即淋巴細胞；加入1ml培養基重懸，吸取50μl到1.5ml離心管，加450μl磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，顯微鏡下計數并用臺盼藍染色觀察細胞活性；細胞活性為95％以上，調整細胞濃度為1×10⁶個/ml，將細胞接種在24孔板中；

步驟5、流式細胞術檢測CD₄⁺和CD₈⁺T細胞Cx43表達收集5×10⁵個細胞于EP管內，100μl PBS重懸細胞，分別加入相應流式抗體1μl，CD₄-APC，APC同型對照；CD₈-PE，PE同型對照，并設立陰性對照；125μl固定劑固定淋巴細胞，4℃孵育20min，Cx43一抗1μl抗體與99μl 1×破膜劑破膜，37℃孵育20min；FITC二抗1μl，37℃孵育20min；1ml 1×破膜劑洗滌，棄上清液，PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測，流式CELLQuest軟件進行分析；

步驟6、實時熒光定量PCR檢測IL-2mRNA和IL-6mRNA表達計數分離出的淋巴細胞，調整培養基至細胞濃度為1×10⁶個/ml；將淋巴細胞分為空白對照組、刀豆蛋白組和Gap27+ConA組；加入10％自體血清，血清處理步驟：56℃滅活30min，以4 000r/min離心30min，4℃保存，于37℃，5％CO₂培養箱中培養48h；

TRIzol法提取上述培養的淋巴細胞mRNA，核酸蛋白含量檢測儀測定A₂₆₀/A₂₈₀值，1％甲醛變性凝膠電泳檢測提取質量；選用GADPH作為內參基因，根據大鼠IL-2、IL-6基因cDNA序列，設定引物序列；將提取的mRNA樣品、隨機引物、Rtmix、dNTP混合液、焦碳酸二乙酯水按照反轉錄體系配制反應體系，按照37℃反轉錄60min，90℃滅活反轉錄酶5min的反應程序進行反轉錄合成cDNA；將2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix，10×miScript Nucleics Mix通用引物，模板cDNA和RNase-Free water置于冰上，并輕輕混勻，配制反應體系，按照95℃預變性2min，1個循環；95℃變性5s，60℃退火加延伸10s，40個循環設置Bio-Rad熒光定量PCR儀，記錄IL-2mRNA與IL-6mRNA相對表達量；

Gap27使淋巴細胞炎性因子IL-2mRNA和IL-6mRNA表達下調，提示縫隙連接阻斷劑通過改變Cx43通道結構或抑制細胞內Ca2+濃度進而改變通道通透性，從而影響細胞因子的釋放。