[發明專利]類角膜內皮細胞的獲取方法

有效

• 申請號: 201611167154.5
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106635955B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 范國平;王云娟;方攀峰;李寧
• 申請（專利權）人: 江蘇艾爾康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0735;A61L27/38
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 楊海明

本發明涉及一種類角膜內皮細胞的獲取方法，屬于細胞生物技術領域。其通過擬胚體的獲取、預分化培養和分化培養獲得類角膜內皮細胞。本發明提供的通過體外分化人類多能干細胞的方法獲得類角膜內皮細胞，可以作為替代捐贈的角膜內皮細胞的理想細胞來源。本發明方法采用商業化的人類胚胎干細胞，因為其具有自我復制和無限增殖的能力以及分化潛能，因此類角膜內皮細胞的獲得具有充足的來源。本發明解決了類角膜內皮細胞在體外分化比率低的問題，提高了類角膜內皮細胞在體外分化效率，自擬胚體階段至獲取類角膜內皮細胞時間最快為11天。本發明方法技術方案簡便、易操作。

技術領域

本發明涉及一種類角膜內皮細胞的獲取方法，屬于細胞生物技術領域。

背景技術

角膜內皮細胞是一個有規律六邊形排列的單層細胞，是角膜基質與房水前房隔開的生理屏障，并在保持角膜透明度方面發揮關鍵作用。角膜內皮細胞減少或損傷的原因有：①隨著年齡的增加逐漸減少；②感染、炎癥、外傷(如機械傷、化學傷、產傷、激光射線等)、眼部手術(如白內障手術，抗青光眼手術，及其他眼內操作如前房異物取出等)、遺傳性疾病、代謝性疾病等都可引起內皮細胞的減少和損傷。因為成體角膜內皮細胞沒有增殖能力，受損后主要依賴損傷區周邊細胞的擴展和移行進行修復，當角膜內皮細胞的密度變得極低，內皮細胞障礙物和泵的功能將不足以維持適當的基質水合作用，導致角膜失代償或大皰性角膜病變或角膜水腫，患者視力受損并最終視力喪失。

臨床上，角膜移植是治療人類角膜內皮細胞疾病唯一有效的療法。但是角膜供體來源匱乏是全世界面臨的難題，極大地限制了角膜移植手術的開展，使眾多角膜病患者不能得到及時醫治，只能在痛苦中等待角膜材料，帶來極大的社會負擔。近年來，隨著角膜移植技術的進步，Descemet膜技術(DMEK)的開發，即只有角膜內皮和Descemet膜來實現良好的視力恢復技術。然而，這種療法顯著限制于角膜內皮細胞捐贈來源的短缺。因此，基于干細胞的技術被認為是替代治療人角膜內皮細胞缺失引起的疾病的一種很有前途的方法。

發明內容

本發明的目的在于克服上述不足之處，提供了體外分化人類多能干細胞獲取類角膜內皮細胞的方法。

本發明還提供了體外分化獲取的類角膜內皮細胞的鑒定指標。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：

類角膜內皮細胞的獲取方法，步驟如下：

(1)擬胚體的獲取：將人類胚胎干細胞培養在小鼠胚胎成纖維細胞上，用膠原酶Ⅳ和DispaseII鋪滿培養器皿進行消化后，采用無血清培養基培養，以獲取擬胚體；

(2)預分化培養：將步驟(1)獲取的擬胚體采用補充了頭蛋白和TGF-β1受體抑制劑的分化培養基A中培養4～5天或分化培養基B中培養12～16天，即獲得預分化培養中間細胞；

(3)分化培養：將步驟(2)預分化培養后中間細胞轉移至包被了硫酸軟骨素和層粘連蛋白的培養器皿中，采用分化培養基C培養7～8天或采用分化培養基D培養25～40天，即獲得類角膜內皮細胞。

步驟(1)中所述的膠原酶Ⅳ和中性蛋白酶DispaseII的配比是1：1～5，其中配置前，膠原酶Ⅳ的濃度為400-1000U/mL，中性蛋白酶DispaseII的濃度為1～6U/mL；

無血清培養基：基礎培養基為DMEM/F12培養基，并添加了10％～20％的血清替代物，10～20ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，1×非必需氨基酸，2mM的GlutaMAX^TM培養基及添加劑，100單位/mL的青-鏈雙抗，0.1mM的β-巰基乙醇；

所述的步驟(2)中補充頭蛋白后的濃度是300～1000ng/mL；補充TGF-β1受體抑制劑后的濃度是2.5～15μM。