[發明專利]類角膜內皮細胞的獲取方法

有效

• 申請號: 201611167154.5
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106635955B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 范國平;王云娟;方攀峰;李寧
• 申請（專利權）人: 江蘇艾爾康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0735;A61L27/38
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 楊海明

1.類角膜內皮細胞的獲取方法，其特征在于，步驟如下：

(1)擬胚體的獲取：將商品化的人類胚胎干細胞培養在小鼠胚胎成纖維細胞上，用膠原酶Ⅳ和DispaseII鋪滿培養器皿進行消化后，采用無血清培養基培養，以獲取擬胚體；

(2)預分化培養：將步驟(1)獲取的擬胚體采用補充了頭蛋白和TGF-β1受體抑制劑的分化培養基A中培養4天，即獲得預分化培養中間細胞；

(3)分化培養：將步驟(2)預分化培養后中間細胞轉移至包被了硫酸軟骨素和層粘連蛋白的培養器皿中，采用分化培養基C培養7天，即獲得類角膜內皮細胞；

步驟(1)中所述的膠原酶Ⅳ和中性蛋白酶DispaseII的配比是1：1～5，其中配置前，膠原酶Ⅳ的濃度為400-1000U/mL，中性蛋白酶DispaseII的濃度為1～6U/mL；

無血清培養基：基礎培養基為DMEM/F12培養基，并添加了10％～20％的血清替代物，10～20ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，1×非必需氨基酸，2mM的GlutaMAX^TM培養基及添加劑，100單位/mL的青-鏈雙抗，0.1mM的β-巰基乙醇；

所述的步驟(2)中補充頭蛋白后的濃度是300～1000ng/mL；補充TGF-β1受體抑制劑后的濃度是2.5～15μM；

步驟(2)中所述分化培養基A：基礎培養基DMEM/F12培養基，添加了1×N2添加劑，10～20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培養基及添加劑，100單位/mL青-鏈雙抗，2～10ng/mL重組人胰島素；

步驟(3)中所述分化培養基C：基礎培養基由DMEM/F12和M199以1～1.5:1的比例配制而成，并添加了5～20％胎牛血清，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培養基及添加劑，100單位/mL青-鏈霉素青鏈雙抗，2～10ng/mL重組人胰島素，20～50mg/mL左旋維生素C，10～20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子。

2.根據權利要求1所述類角膜內皮細胞的獲取方法，其特征在于：所述的步驟(3)培養器皿包被的硫酸軟骨素濃度為10～50mg/mL；層粘連蛋白濃度為1～10μg/mL。

3.根據權利要求1所述類角膜內皮細胞的獲取方法，其特征在于：將預分化培養所獲取的中間細胞的標志物HNK-1和P75免疫熒光染色呈陽性表達；獲取的類角膜內皮細胞的標志物鈉-鉀-ATP酶、S100A4蛋白、水通道蛋白-1即AQP-1和緊密連接蛋白ZO-1免疫染色呈陽性表達。