[發(fā)明專利]藻類培養(yǎng)中腔輪蟲的快速定量檢測(cè)qPCR方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611166619.5
• 申請(qǐng)日: 2016-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN106755392B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔迎春;李煥楠;胡強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國投生物科技投資有限公司;中國科學(xué)院水生生物研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/6893;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時(shí)代知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

本發(fā)明首先提供腔輪蟲CoI基因在作為用于藻類培養(yǎng)中危害腔輪蟲的快速定量檢測(cè)qPCR方法的分子標(biāo)記中的應(yīng)用，以及如SEQ ID No.1?3所示的DNA分子標(biāo)記和特異性引物組；接著提供一種藻類培養(yǎng)中危害腔輪蟲的快速定量檢測(cè)qPCR方法，采用上述的特異性引物組，對(duì)待測(cè)樣品的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR。本發(fā)明的技術(shù)效果是找到一種分子標(biāo)記并設(shè)計(jì)出特異性引物，可以有效的將腔輪蟲在藻類培養(yǎng)過程中有其他污染原生動(dòng)物存在的條件下鑒定出來。極大地提高了檢測(cè)的敏感性和特異性，縮短了試驗(yàn)時(shí)間，簡化了操作，而且熒光檢測(cè)的結(jié)果由電腦軟件分析，避免了產(chǎn)物后處理過程所致的污染，較常規(guī)PCR更為客觀、靈敏、準(zhǔn)確。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及在藻類大規(guī)模培養(yǎng)中對(duì)腔輪蟲進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)的qPCR方法。

背景技術(shù)

腔輪蟲是在藻類大規(guī)模培養(yǎng)中存在的一種重要污染原生動(dòng)物，它們是一類廣泛的淡水輪蟲。目前已經(jīng)在小球藻、柵藻以及血球藻的大規(guī)模培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)并爆發(fā)，一經(jīng)感染，可使藻類大規(guī)模培養(yǎng)在2至4天內(nèi)完全潰敗，導(dǎo)致“泡湯”，從而給藻類的大規(guī)模培養(yǎng)帶來極大危害。因此對(duì)于藻類培養(yǎng)中存在的腔輪蟲的早期監(jiān)測(cè)和分子鑒定方法的確定至關(guān)重要。

目前對(duì)腔輪蟲的研究比較局限，僅在于對(duì)其的分類，中卻多樣性及群落結(jié)構(gòu)等方面對(duì)其進(jìn)行研究，而幾乎沒有對(duì)于其對(duì)大規(guī)模藻類培養(yǎng)造成的危害進(jìn)行研究，在環(huán)境條件不利于生產(chǎn)繁殖的時(shí)候便形成休眠孢囊存在，對(duì)于在大規(guī)模藻類培養(yǎng)很難在顯微鏡中觀察到它們的存在，并且傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察靈敏度低，在原生動(dòng)物存在數(shù)量很大的前提下才可以完成。而DNA直接測(cè)序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)存在檢測(cè)效率低，當(dāng)DNA含量很低的情況下不能被檢出，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象，也經(jīng)常會(huì)影響對(duì)實(shí)際情況的判斷。并且采用以上方法對(duì)腔輪蟲進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候，就說明存在數(shù)量已經(jīng)很大，而這種存在量已足以使藻類大規(guī)模培養(yǎng)發(fā)生完全潰敗。因此，對(duì)腔輪蟲的早期監(jiān)測(cè)和分子鑒定的方法尤為重要。

隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，在原生動(dòng)物的檢測(cè)手段方面已發(fā)展迅速，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)以其檢測(cè)速度快，靈敏度高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)在原生動(dòng)物的分子檢測(cè)中和貝類病原檢測(cè)中已得到廣泛的應(yīng)用。在貝類上的原生動(dòng)物檢測(cè)靈敏度以達(dá)到30拷貝。因此，對(duì)于腔輪蟲的檢測(cè)急需要熒光定量PCR這種靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快的檢測(cè)手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了在藻類培養(yǎng)早期快速監(jiān)測(cè)到污染物的存在，提供一種腔輪蟲的熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法較傳統(tǒng)的PCR方法具有更高的靈敏度，且操作簡便，可進(jìn)行大量的樣品檢測(cè)，并對(duì)腔輪蟲進(jìn)行定量，從而為藻類培養(yǎng)早期腔輪蟲污染的檢測(cè)和監(jiān)控提供有效方法。

本發(fā)明的第一個(gè)技術(shù)目的是提供腔輪蟲CoI基因在作為用于藻類培養(yǎng)中危害腔輪蟲的快速定量檢測(cè)qPCR方法的分子標(biāo)記中的應(yīng)用。由于原生動(dòng)物基因序列相似度較大，如直接采用DNA直接測(cè)序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，經(jīng)常出現(xiàn)檢測(cè)效率低，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。而本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)研究后，發(fā)現(xiàn)采用腔輪蟲CoI基因的特異性區(qū)域片段作為分子標(biāo)記進(jìn)行qPCR，可以有效的將腔輪蟲在藻類培養(yǎng)過程中有其他污染原生動(dòng)物存在的條件下鑒定出來。同時(shí)，本發(fā)明以CoI基因作為分子標(biāo)記，還具有以下特點(diǎn)：(1)CoI基因作為分子標(biāo)記可以使用很短的序列就可以進(jìn)行區(qū)分，而其他的分子標(biāo)記所涉序列比較長，比較復(fù)雜且容易誤判；(2)CoI基因能夠準(zhǔn)確區(qū)分出物種差異，具有特異性；(3)CoI基因存在于線粒體，每個(gè)生物細(xì)胞內(nèi)有若干個(gè)線粒體，檢測(cè)時(shí)可以放大，具有很高靈敏度。

本發(fā)明的第二個(gè)技術(shù)目的是提供一種DNA分子標(biāo)記，包含腔輪蟲CoI基因的三段特異性區(qū)域序列，其序列分別如SEQ ID No.1-3所示。

接著提供一組引物組，包含三對(duì)引物，分別用于特異性擴(kuò)增序列SEQ ID No.1-3，各自的上下游引物序列如下(如SEQ ID No.4-9所示)：

(1)CoI-1F：5’-TAATGTTAGGGGTTGCTGAT-3’；