[發明專利]藻類培養中腔輪蟲的快速定量檢測qPCR方法

有效

• 申請號: 201611166619.5
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106755392B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 龔迎春;李煥楠;胡強
• 申請（專利權）人: 國投生物科技投資有限公司;中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6893;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

1.一組引物組，其特征在于，包含三對引物，分別用于特異性擴增序列SEQ ID No.1-3，各對的上下游引物序列如下：

（1）CoI-1F：5’- TAATGTTAGGGGTTGCTGAT -3’；

CoI-1R：5’- ATGAAGTTACTAATAAAATAGCTGT -3’；

（2）CoI-2F：5’- TTATCTTCTATTCTGGATGCTG -3’；

CoI-2R：5’- TTGGTATAATACAGGATTGCC -3’；

（3）CoI-3F：5’- GTTCTCGTACAACAAAAATGAT -3’；

CoI-3R：5’- TTGGTATAATACAGGATTGCC-3’。

2.權利要求1所述引物組在藻類培養中腔輪蟲的快速定量檢測qPCR方法中的應用。

3.一種藻類培養中腔輪蟲的快速定量檢測qPCR方法，其特征在于，采用權利要求1所述的引物組，對待測樣品的基因組DNA進行熒光定量PCR檢測，采用權利要求1所述引物組中的任意一對 引物，將包含目的擴增片段的基因克隆到質粒PGEM-T中，構建重組質粒作為檢測腔輪蟲濃度的定量標準品，檢測結果的判斷方法如下：

（1）陽性對照的Ct值應小于36.0，陰性對照的Ct值應大于39.0；陽性標準品為重組質粒，陰性標準品為無菌雙蒸水；

（2）若Ct值小于36.0，且呈現典型的擴增曲線，則判定為陽性結果，表明檢測樣品中含有腔輪蟲；

（3）若Ct值大于39.0或無擴增信號，則判定為陰性結果，表明檢測樣品中無腔輪蟲；

（4）若Ct值在36.0～39.0之間，則視為可疑結果，樣品需重復檢驗一次；若結果仍在此范圍內，則判定為陰性結果；

結果呈陽性的樣品，根據其Ct值以及建立的定量標準曲線計算樣品內的腔輪蟲含量。

4.根據權利要求3所述的快速定量檢測qPCR方法，其特征在于，所述引物組中各上游引物和下游引物的濃度均為10 μ mol/L，反應終濃度為0.25μ mol/L。

5.根據權利要求3所述的快速定量檢測qPCR方法，其特征在于，所述熒光定量PCR采用的熒光染料為SYBR Green 染料，熒光檢測波長為470-514 nm。

6.根據權利要求3所述的快速定量檢測qPCR方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的反應體系為： 2×的LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master 10μL，10μ mol/L的上游引物0.5μL，10μ mol/L的下游引物0.5μL，DNA模板1μL，加水至總體積20μL。

7.根據權利要求3所述的快速定量檢測qPCR方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的反應程序為： 95℃5min，1個循環； 95℃10s、56℃20s、72℃30s，40個循環。

8.一種qPCR試劑盒，其包括權利要求1所述的引物組。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：包括檢測試劑和基因組DNA提取試劑。

10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于：所述檢測試劑包括熒光染料、權利要求3所述的陽性標準品。

11.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于：所述基因組DNA提取試劑包括Roche 的High Pure Template Preparation Kit試劑盒。