[發明專利]一種三唑磷定性定量分析的方法及該方法所用的試劑盒

在審

• 申請號: 201611165203.1
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106596957A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 金茂俊;王靜;杜鵬飛;金芬;佘永新;邵華;鄭鷺飛;王珊珊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙)11371
• 代理人: 齊云

技術領域

本發明涉及食品安全檢測免疫分析技術領域，具體而言，涉及一種三唑磷定性定量分析的方法及該方法所用的試劑盒。

背景技術

隨著高毒農藥品種將逐步從市場退出，三唑磷已成為替代甲胺磷農藥的主要品種，廣泛用于長江中下游流域水稻二化螟的防治。近年來其使用量迅速增加，在三唑磷農藥在我國正進入市場旺季的同時，國外已經開始限制或禁止三唑磷農藥的使用與銷售。2004年11月28日，國家質檢總局發布緊急預警，稱歐盟于12月31日起正式禁止320種農藥在歐盟銷售。其中涉及中國正在生產、使用以及出口的農藥達60多個品種，其中就包括了三唑磷農藥。其他家和地區對三唑磷的最大殘留限量也提出了越來越嚴格的標準：日本規定稻米中三唑磷的最大殘留限量(MRL)為不得檢出；歐盟除茶葉為0.05mg/kg、棉籽0.1mg/kg外，其余樣品為0.02mg/kg；我國三唑磷的最大殘留限量一般都限定為0.05mg/kg。因此，加強三唑磷檢測方法學研究對于保障我國食品安全和農產品貿易具有重要意義。

免疫分析方法的作用和地位目前已得到國內外學者的廣泛認可，免疫分析方法的研究也是檢測方法研究最熱門的領域之一。在免疫分析方法領域中，我國在酶聯免疫分析方法方面開展了較為深入的研究，包括半抗原合成、抗體制備、標記物偶聯、反應體系中各種理化性質對免疫分析方法的影響及半抗原結構與其所制備得到抗體之間的構效關系等方面。近年來，我國學者在熒光免疫分析、化學發光免疫分析、生物傳感器和生物條形碼免疫分析方法方面也開展了較多的研究工作。

生物條形碼分析方法近十年來在痕量蛋白質和核酸檢測方法得到了快速的發展，通過與免疫反應相結合建立的生物條形碼免疫分析方法，將免疫分析方法的檢測限提高到了一個新的高度。然而該方法建立至今，只能通過構建“三明治”結構模式實現對蛋白質等大分子物質的檢測。由于小分子化合物通常情況下只有一個抗原結合位點，因此目前生物條形碼免疫分析方法采用的“三明治”結構模式基本不能適用于農獸藥或生物毒素等小分子物質的檢測。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒，使用該試劑盒與實施定量PCR聯用，可以特異地定量檢測水中或食品中三唑磷含量。該試劑盒通過競爭反應體系進行檢測，克服了目前生物條形碼免疫分析方法采用的“三明治”結構模式基本不能適用于三唑磷的檢測的缺陷。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

一種三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒，所述試劑盒包含有：

三唑磷標準品、三唑磷納米探針、三唑磷雙標膠體金納米探針；

所述三唑磷納米探針由磁性納米粒子和三唑磷完全抗原偶聯而成；

所述三唑磷雙標膠體金納米探針由抗三唑磷抗體和雙鏈DNA包被膠體金顆粒得到；

所述雙鏈DNA由硫醇修飾的單鏈DNA和條形碼單鏈DNA互補配對而成。

三唑磷(Triazophos)分子式：C₁₂H₁₆N₃O₃PS；CAS號：24017-47-8。

本發明通過改變生物條形碼免疫分析方法的現有反應模式，建立基于小分子競爭反應模式的生物條形碼免疫分析方法。通過將農藥小分子半抗原與載體蛋白的偶聯物包被于磁性納米粒子表面，并于膠體金納米探針表面結合農藥抗體和起信號放大作用的生物條形碼，利用磁性納米粒子表面的包被抗原與農藥分子競爭結合膠體金納米探針表面的抗體建立競爭型免疫化學反應體系。

本發明通過改變生物條形碼免疫分析方法的現有反應模式，建立基于小分子競爭反應模式的生物條形碼免疫分析方法。通過將三唑磷與載體蛋白的偶聯物包被于磁性納米粒子表面制備三唑磷納米探針，并于膠體金納米探針表面結合農藥抗體和起信號放大作用的生物條形碼用以制備三唑磷雙標膠體金納米探針，利用磁性納米粒子表面的包被抗原與農藥分子競爭結合膠體金納米探針表面的抗體建立競爭型免疫化學反應體系。利用磁分離系統分離免疫結合的抗原抗體復合物，采用熱變性技術促使膠體金納米探針釋放生物條形碼，并利用熒光定量PCR技術生物條形碼含量，實現對三唑磷農藥的定量檢測。

該試劑盒的使用效果具有簡便、快速、靈敏、特異、穩定等優點。并且，根據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，特別適合廣大的質檢機構推廣使用，為食品安全檢測提供一種非常有價值的檢測手段。