[發(fā)明專利]一種三唑磷定性定量分析的方法及該方法所用的試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611165203.1
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106596957A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金茂俊;王靜;杜鵬飛;金芬;佘永新;邵華;鄭鷺飛;王珊珊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11371
• 代理人: 齊云

1.一種三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含有：

三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品、三唑磷納米探針、三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針；

所述三唑磷納米探針由磁性納米粒子和三唑磷完全抗原偶聯(lián)而成；

所述三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針由抗三唑磷抗體和雙鏈DNA包被膠體金顆粒得到；

所述雙鏈DNA由硫醇修飾的單鏈DNA和條形碼單鏈DNA互補配對而成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述三唑磷完全抗原由三唑磷和載體蛋白偶聯(lián)而成。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，述載體蛋白為雞卵白蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁性納米粒子的粒徑為18～22nm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述膠體金顆粒的粒徑為13～15nm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述抗三唑磷抗體為單克隆抗體。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針具體由以下方法制備得到：

1)、取膠體金溶液調(diào)pH至8.8～9.2后向其中加入抗三唑磷抗體，攪拌混合，靜置25～35min；然后加入硫醇修飾的單鏈DNA鏈，8～12℃靜置36～44h；再調(diào)整pH至7.3～7.5，加入NaCl至濃度0.08～0.12mol/L，8000～11000r/min離心8～12min，棄上清，得到含寡核苷酸的膠體金；

2)、用牛血清白蛋白濃度為0.8～1.2％的磷酸鹽緩沖溶液重懸所述含寡核苷酸的膠體金，孵育1～3h；再加入與所述硫醇修飾的單鏈DNA鏈互補的生物條形碼DNA鏈，室溫雜交3～5h，8000～11000r/min離心，棄上清，得到所述三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于：

在加入NaCl至既定濃度時，在120～180min內(nèi)分2～4次等量加入，每次間隔40～60min。

9.一種三唑磷定性定量分析的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～8任一項所述的試劑盒與熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的三唑磷定性定量分析的方法，其特征在于，該方法具體包括：

a)、將三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品、提取與凈化后的待測樣品分別與等體積的三唑磷雙標(biāo)膠體金探針和三唑磷納米探針混合孵育；

b)、洗滌孵育產(chǎn)物并去雜化得到與各標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品對應(yīng)的生物條形碼；

c)、使用熒光定量PCR對生物條形碼進行測定；

d)、以三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，各濃度所對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中的三唑磷濃度。