[發明專利]一種石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201611159701.5
• 申請日: 2016-12-15
• 公開（公告）號: CN106591328B
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 袁于人;殷波;陸洲
• 申請（專利權）人: 斯澳生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/70;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 蘇州國誠專利代理有限公司 32293
• 代理人: 韓鳳

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的制備及其應用，含以下步驟：將含有石斑魚神經壞死病毒(NNV)衣殼蛋白基因的重組載體pET32a?NNV轉化到大腸桿菌BL21，誘導融合基因進行表達；將表達后的NNV衣殼蛋白包涵體進行純化；將純化后的NNV衣殼蛋白添加到黃粉蟲飼料中，將蟲體培養至特定階段，冷凍干燥并碾磨成粉末；用蟲體粉末喂食石斑魚，使石斑魚免疫神經壞死病毒。本發明提供的方法可以使用大腸桿菌大量表達NNV衣殼蛋白；食用了NNV衣殼蛋白的黃粉蟲體粉能有效提高石斑魚對神經壞死病的免疫力。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的制備方法。

背景技術

石斑魚是一種重要的經濟魚類，尤其是在亞洲。神經壞死病毒(NNV)可攻擊石斑魚的神經系統，造成致命性的病毒腦病和視網膜病變。NNV一旦爆發會造成仔、稚魚的大量死亡，發病后死亡率高達80-100％，帶來巨大的經濟損失，成為限制石斑魚養殖業發展的主要瓶頸。

石斑魚神經壞死病毒(NNV)屬于Betanodaviridae病毒屬Betanodavirus科，能在許多魚類中傳播。魚類患病后出現神經紊亂癥狀，中樞神經系統和視網膜有局部空泡，并伴有螺旋式游泳，魚鰾控制異常等表現。至今已從14個科30種以上的海洋魚類體內分離出NNV。NNV基因組包含兩條正義RNA連，其中RNA1編碼一個RNA依賴的RNA聚合酶，RNA2編碼病毒衣殼蛋白。在NNV基因所編碼的蛋白中，衣殼蛋白具有免疫活性，可被用于制作疫苗。利用基因工程技術可在大腸桿菌中高效表達病毒衣殼蛋白，然而，由于原核細胞結構簡單，通常在大量表達的同時不能使NNV衣殼蛋白正確折疊，最終呈包涵體形式存在，成為NNV疫苗開發的一大障礙。克服這一問題是當前石斑魚神經壞死病的免疫防治迫切需求。

發明內容

一種石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的制備方法及其應用，其特征在于，包

含以下步驟：

(1)將含有斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白基因的重組質粒pET32a-NNV轉化到大腸桿菌BL21中，37℃、250rpm條件下，當OD達到0.6時加入IPTG，直至IPTG終濃度為1mM，降溫至25℃，誘導表達12h；

(2)誘導表達完成后離心收集菌體，破碎，對包涵體進行純化，將純化后的包涵體冷凍干燥，碾磨成粉末，過80目篩。

進一步的，所述石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白大小為37kDa。

進一步的，所述石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白基因序列為Seq ID No1。

進一步的，所述石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白序列為Seq ID No2。

進一步的，所述步驟(2)中離心是在10000rpm轉速下離心20min，棄上清。

進一步的，所述步驟(2)中破碎是將收集的菌體用裂解液重懸后采用高壓均質機破碎，每次破碎壓力為1000bar，時間為10min，共破碎3次。

進一步的，所述裂解液組成為：10mM Tris-HCl(pH 7.1)、100mM NaCl、125mM咪唑。

進一步的，所述步驟(2)中，石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白包涵體純化步驟為：(1)取破碎后的菌體在20000rpm條件下離心30min后棄去上清，沉淀加入緩沖液B1，混勻后25℃振蕩30min；(2)20000rpm離心30min后棄去上清，加入緩沖液B2，混勻后25℃振蕩30min；(3)20000rpm離心30min后棄去上清，加入純水，混勻后25℃振蕩30min；(4)重復步驟(3)兩次；(5)20000rpm離心30min后棄去上清，沉淀冷凍干燥后碾磨成粉末。