[發明專利]一種石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的制備方法及其應用有效
| 申請號： | 201611159701.5 | 申請日： | 2016-12-15 |
| 公開（公告）號： | CN106591328B | 公開（公告）日： | 2019-07-05 |
| 發明（設計）人： | 袁于人;殷波;陸洲 | 申請（專利權）人： | 斯澳生物科技（蘇州）有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/40 | 分類號： | C12N15/40;C12N15/70;A61K39/12;A61P31/14 |
| 代理公司： | 蘇州國誠專利代理有限公司 32293 | 代理人： | 韓鳳 |
| 地址： | 215123 江蘇省蘇州*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 衣殼蛋白 石斑魚 神經壞死病毒 大腸桿菌 黃粉蟲 蟲體 制備 生物技術領域 衣殼蛋白基因 融合基因 重組載體 包涵體 壞死病 碾磨 喂食 免疫力 應用 誘導 食用 神經 飼料 轉化 | ||
1.一種石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的制備方法，其特征在于，包含以下步驟：
(1)將含有石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白基因的重組質粒pET32a-NNV轉化到大腸桿菌BL21中，37℃、250rpm條件下，當OD600達到0.6時加入IPTG，直至IPTG終濃度為1mM，降溫至25℃，誘導表達12h；
(2)誘導表達完成后離心收集菌體，破碎，對包涵體進行純化，將純化后的包涵體冷凍干燥，碾磨成粉末，過80目篩；
所述石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白大小為37kDa；
所表達石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白的基因序列為Seq ID No1。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所表達石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白序列為Seq ID No2。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中離心是在10000rpm轉速下離心20min，棄上清。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中破碎是將收集的菌體用裂解液重懸后采用高壓均質機破碎，每次破碎壓力為1000bar，時間為10min，共破碎3次；
其中，所述裂解液組成為：10mM的pH為 7.1的Tris-HCl、100mM NaCl、125mM咪唑。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，石斑魚神經壞死病毒衣殼蛋白包涵體純化步驟為：(1)取破碎后的菌體在20000rpm條件下離心30min后棄去上清，沉淀加入緩沖液B1，混勻后25℃振蕩30min；(2)20000rpm離心30min后棄去上清，加入緩沖液B2，混勻后25℃振蕩30min；(3)20000rpm離心30min后棄去上清，加入純水，混勻后25℃振蕩30min；(4)重復步驟(3)兩次；(5)20000rpm離心30min后棄去上清，沉淀冷凍干燥后碾磨成粉末。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液B1組成為：10mM 的pH為7.1的Tris-HCl、100mM NaCl、1％TritonX-100；緩沖液B2組成為：10mM 的pH為 7.1的Tris-HCl、100mMNaCl。
7.根據權利要求1-6任一項所述的衣殼蛋白的應用方法，其特征在于，將所述衣殼蛋白粉末添加到飼料中，喂食3齡期黃粉蟲，培養至4齡期時，將蟲體冷凍干燥并碾磨成粉末，并過80目篩，即得抗神經壞死病毒天然藥劑。
8.根據權利要求7所述的應用方法，其特征在于，所述抗神經壞死病毒天然藥劑的應用方法為，將衣殼蛋白粉末按黃粉蟲平均體重的1％添加到飼料中。
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