[發明專利]一種從環境樣品中提取純化總細菌的方法

在審

• 申請號: 201611152634.4
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN107164229A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 曹冶;謝晶;于吉鋒;廖黨金;林毅;魏勇;戴卓建;李興玉;張先惠;葉健強;趙素君;李江凌;葉勇剛;王秋實;潘夢
• 申請（專利權）人: 四川省畜牧科學研究院
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12Q1/10;C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 成都華風專利事務所(普通合伙)51223
• 代理人: 杜朗宇

技術領域

本發明涉及一種從環境樣品中提取純化總細菌的方法，屬于環境科學與生物技術領域。

背景技術

隨著科技的進步，PCR技術逐漸被應用到環境微生物中特定細菌的檢測中，如土壤、未經處理的生活廢棄物、醫院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環境中的微生物檢測。

隨著規?；?、集約化養殖場數量的增加，畜禽的糞便和污水排放量劇增，環境污染問題越來越突出，一些致病性微生物如豬副豬嗜血桿菌、沙門桿菌等混跡其間，將對人畜健康造成極大的危害，也會給養殖業的健康發展帶來無法估量的經濟損失。因此，需要對養殖場環境病原微生物進行實時監測，以防止動物疫病的爆發與蔓延。

迄今，對病原菌的檢測和鑒定大多采用傳統的方法，即對病料進行病原培養分離，配合血清型鑒定來診斷畜禽疾病。該方法雖然比較準確，但耗時費力，鑒定時間長(一般需要2～4天)，易受細菌生理條件和抗生素使用限制，常導致培養假陰性，很難滿足臨床要求。

PCR技術以其敏感性強，特異性好，檢測時間短等特點被廣泛應用于許多病原菌的快速鑒定。但對于環境中的病原菌而言，環境中存在大量干擾物質影響PCR檢測，如腐殖質等。所以傳統的解決辦法就是采用去除腐殖質試劑對樣品進行洗滌，去除腐殖質，然后用裂解試劑裂解環境中的細菌，析出DNA復合物，用蛋白酶去除DNP中的蛋白質，析出DNA，再經純化，洗滌作為DNA檢測的樣品試劑。此類方法存在繁瑣的DNA的提取純化過程，且常常會導致提取失敗。目前市場上有針對具體病原菌DNA提取的試劑盒，但步驟繁多，且價格昂貴，難以推廣進行日常使用。

菌落PCR因為不用提取細菌DNA而直接進行檢測而廣受追捧，但如何提取純化能直接用于PCR檢測的環境樣品中的病原菌，仍然是一個很難解決的問題。

因此，在生產實踐中，亟需快速檢測鑒定技術來幫助廣大基層獸醫工作者來快速診斷檢測，為盡早防治病原菌的侵襲提供寶貴的時間。

發明內容

本發明提供了一種從環境樣品中提取純化總細菌的方法，它包括如下操作步驟：

(1)取環境樣品，加入水或緩沖液，混勻；

(2)加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，待溶劑分層，移取上層備用；

(3)將移取的上層進行離心，棄上清，保留沉淀；

(4)將沉淀洗滌至基本無色，用無菌水或緩沖液重懸菌液即可。

本方法可用于多種環境中的總細菌的提取純化，如土壤、未經處理的生活廢棄物、醫院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環境中微生物的提取純化。本發明一個具體實施方式中，用于提取純化(包括檢測)的環境樣品為養殖環境中的糞樣、墊草、墊土(即土壤)。

優選地，加入環境樣品中和重懸沉淀(總細菌)的水為無菌水(如ddH₂O)或無菌生理鹽水，緩沖液為PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液。

進一步優選地，加入環境樣品中和重懸沉淀(總細菌)的為PBS緩沖液，其效果略優于水和其他緩沖液。

優選地，環境樣品和PBS緩沖液的質量體積比為1g：3ml。

所述“溶劑分層”，是指步驟(2)引入的有機溶劑與步驟(1)中引入的水或緩沖液，由于兩者不能完全互溶而分為兩層(也可以稱為兩相)，本發明中取上層(主要是水相)。但有機溶劑與水或緩沖液可能會有一定互溶比例，因此，不排除各相溶劑中均含有一定量的有機溶劑和水。本發明中溶劑分層，可以采取多種方式，如靜置、離心等。

優選地，步驟(2)中，苯酚-氯仿-異戊醇混合液中，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1～100:24:1

進一步優選地，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。

優選地，步驟(2)中，加入的苯酚-氯仿-異戊醇混合液與PBS緩沖液的體積比為5:3。

優選地，步驟(4)中，洗滌液為TENPP緩沖液，TENPP緩沖液組成為：50mmol/L Tris，20mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，1％PVPP，pH 10.0。

通常洗滌3～5次沉淀即可洗至基本無色，重懸菌液可用無菌水或各種常用的緩沖液，如PBS緩沖液，Tris緩沖液等。

優選地，上述需離心的各步驟中，離心轉速為12000rpm，離心時間為2～5min。