[發(fā)明專利]一種從環(huán)境樣品中提取純化總細(xì)菌的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611152634.4
• 申請(qǐng)日: 2016-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107164229A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹冶;謝晶;于吉鋒;廖黨金;林毅;魏勇;戴卓建;李興玉;張先惠;葉健強(qiáng);趙素君;李江凌;葉勇剛;王秋實(shí);潘夢(mèng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川省畜牧科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N1/02
• 分類號(hào): C12N1/02;C12Q1/10;C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 成都華風(fēng)專利事務(wù)所(普通合伙)51223
• 代理人: 杜朗宇

1.一種從環(huán)境樣品中提取純化總細(xì)菌的方法，其特征在于：它包括如下操作步驟：

(1)取環(huán)境樣品，加入水或緩沖液，混勻；

(2)加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，待溶劑分層，移取上層備用；

(3)將移取的上層進(jìn)行離心，棄上清，保留沉淀；

(4)將沉淀洗滌至基本無(wú)色，用水或緩沖液重懸菌液即可。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：加入環(huán)境樣品中或重懸沉淀的為PBS緩沖液。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，苯酚-氯仿-異戊醇混合液中，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1～100:24:1。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。

5.如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟(4)中，洗滌液為TENPP緩沖液，TENPP緩沖液組成為：50mmol/L Tris，20mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，1％PVPP，pH 10.0。

6.苯酚-氯仿-異戊醇混合液和TENPP緩沖液用于從環(huán)境樣品中提取純化總細(xì)菌的用途，其特征在于：苯酚-氯仿-異戊醇混合液中，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1～100:24:1；TENPP緩沖液組成為：50mmol/L Tris，20mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，1％PVPP，pH 10.0。

7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于：苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25：24：1。

8.一種檢測(cè)環(huán)境樣品中革蘭氏陰性菌的方法，其特征在于：它包括如下步驟：

(1)采用如權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的方法提取純化總細(xì)菌，重懸菌液備用；

(2)將重懸菌液直接上機(jī)進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增目標(biāo)細(xì)菌的任一段特定的DNA序列；

(3)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，與陽(yáng)性對(duì)照比較，判斷提取純化的總細(xì)菌中是否含有目標(biāo)革蘭氏陰性菌。

9.環(huán)境樣品中布氏桿菌的檢測(cè)方法，其特征在于：采用權(quán)利要求8所述的方法進(jìn)行檢測(cè)，用于擴(kuò)增的上游引物序列如SEQ NO.1所示，下游引物序列如SEQ NO.2所示。

10.環(huán)境樣品中沙門氏菌的檢測(cè)方法，其特征在于：采用權(quán)利要求8所述的方法進(jìn)行檢測(cè)，用于擴(kuò)增的上游引物序列如SEQ NO.3所示，下游引物序列如SEQ NO.4所示。