[發(fā)明專利]利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611151279.9
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號(hào): CN106613973B
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫曉波;蘇家樂;鄧衍明;肖政;梁麗建;劉曉青;項(xiàng)立平
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 楊文晰;孫忠浩

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用組培苗葉片再生不定芽途徑快速繁育羊躑躅的方法；本發(fā)明以羊躑躅無菌組培苗頂生第三到第五個(gè)葉片做為外植體，對葉片垂直于主脈切割一刀并去除葉柄和葉稍，接種在附加激素TDZ 1.0 mg/L和IAA 1.0 mg/L的WPM培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10?15天后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)35天時(shí)葉片不定芽誘導(dǎo)率達(dá)85%以上，不定芽誘導(dǎo)數(shù)平均為7.2個(gè)/葉片。在添加ZT 1.0 mg/L和IBA 0.1?0.5 mg/L的WPM培養(yǎng)基上不定芽生長形成幼苗，幼苗在附加IBA 10?12.5 mg/L和NAA 0.1mg/L的1/2 WPM培養(yǎng)基上發(fā)育成具有根、莖、葉的完整小植株，成株率達(dá)95%以上；本方法適用于羊躑躅試管苗工廠化生產(chǎn)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用組培苗葉片再生不定芽途徑快速繁育羊躑躅的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

羊躑躅(Rhododendron molle(Blume)G.Don)，又名鬧羊花、黃杜鵑、黃色映山紅，隸屬于杜鵑花科杜鵑花屬羊躑躅亞屬落葉灌木，是中國羊躑躅亞屬中僅有的一個(gè)原生種。羊躑躅是有待開發(fā)的優(yōu)良的園林綠化樹種，可引種馴化成為露地栽培的園藝觀賞植物，是杜鵑花色品種改良的重要資源。同時(shí)它也是珍稀瀕危藥用植物，全株器官均含有多種活性成分，花、根、果實(shí)等均可供藥用，具有祛濕、除風(fēng)、解痛等功效，可用于治療風(fēng)濕、頑癬和疼痛等癥；對農(nóng)作物蟲害的防治也有一定的作用，是開發(fā)綠色農(nóng)藥的植物源。羊躑躅主要是通過種子、扦插等方式繁殖。然而羊躑躅種子細(xì)小難采集，且種子萌發(fā)率較低，種子苗生長緩慢，距開花結(jié)果的時(shí)間較長；以扦插、嫁接方式繁殖又存在生根率及移栽成活率極低等問題，使其開發(fā)及利用受到極大限制。因此，亟待采取有效的方法對羊躑躅加以繁殖，使之能夠規(guī)模化生產(chǎn)，滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。

利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖羊躑躅可以不受季節(jié)和環(huán)境條件等因素的影響，并能得到大規(guī)模整齊的瓶苗，且繁殖系數(shù)高，是解決上述難題的重要途徑。國內(nèi)羊躑躅組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究是通過剪取羊躑躅的枝條獲得無菌組培苗，進(jìn)一步通過剪取組培苗的莖節(jié)，誘導(dǎo)和培養(yǎng)嫩莖段腋芽叢生的方式建立羊躑躅離體培養(yǎng)和植株再生體系，芽叢的增殖率為4-5倍以上(顧宏輝,袁群英,朱春艷,朱丹華.羊躑躅的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(4):683；顧地周,陸爽,巴春影,李媛媛.羊躑躅嫩莖離體培養(yǎng)和植株再生[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,43(4):574-578)；以誘導(dǎo)和培養(yǎng)嫩莖段腋芽叢生的方式建立的快繁體系不能作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系對羊躑躅進(jìn)行遺傳改良。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本申請以羊躑躅組培苗頂生第三至第五個(gè)葉片為外植體材料，通過篩選不同的葉片切割方式、暗培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞分裂素和生長素組合，提高葉片不定芽的誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)目，建立高頻率植株再生技術(shù)體系，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法，其具體步驟如下：

A)在超凈工作臺(tái)上剪取羊躑躅無菌組培苗頂生第三到第五個(gè)葉片(該葉片不太老也不太嫩，成熟度適中))，對葉片垂直于主脈切割一刀并去除葉柄和葉稍；

B)將葉片置于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10-15天后進(jìn)行光照培養(yǎng)，同時(shí)觀察葉片，可發(fā)現(xiàn)光照培養(yǎng)13-16天左右，切口處開始出現(xiàn)不定芽；

C)光照培養(yǎng)35天后，將帶不定芽的葉片轉(zhuǎn)到不定芽生長培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，30d后形成幼苗；

D)將幼苗切下，轉(zhuǎn)移到成苗和生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行成苗和生根培養(yǎng)，30d后，幼苗即發(fā)育成具有根、莖和葉的完整再生植株。