[發(fā)明專利]一種方法培養(yǎng)T記憶干細(xì)胞

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611149261.5
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN108218994A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃飛;史子嘯;金濤;王海鷹;何鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 上海恒潤達(dá)生生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N5/10;C12N7/01;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02
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本發(fā)明涉及用含有IL7+IL?15細(xì)胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)CD19 CART細(xì)胞增加了記憶干細(xì)胞表型的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，所用的IL7+IL?15培養(yǎng)基培養(yǎng)出的CD19CART細(xì)胞更易分化成記憶干細(xì)胞表型，T細(xì)胞用IL?7+IL?15預(yù)處理顯示可增加記憶T細(xì)胞功能和CAR?T細(xì)胞的抗腫瘤活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫學(xué)和腫瘤治療領(lǐng)域，更具體地涉及一種培養(yǎng)T細(xì)胞的方法及由所述方法制備的遺傳修飾的T細(xì)胞。

背景技術(shù)

嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T細(xì)胞是指經(jīng)基因修飾后，能以MHC非限制性方式識別特定目的抗原，并且持續(xù)活化擴增的T細(xì)胞。2012年國際細(xì)胞治療協(xié)會年會中指出生物免疫細(xì)胞治療已經(jīng)成為手術(shù)、放療、化療外的第四種治療腫瘤的手段，并將成為未來腫瘤治療必選手段。CAR-T細(xì)胞回輸治療是當(dāng)前腫瘤治療中最明確有效的免疫治療形式。大量研究表明，CAR-T細(xì)胞可以有效的識別腫瘤抗原，引起特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，顯著改善患者的生存狀況。

嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件，賦予T細(xì)胞HLA非依賴的方式識別腫瘤抗原的能力，這使得經(jīng)過CAR改造的T細(xì)胞相較于天然T細(xì)胞表面受體TCR能夠識別更廣泛的目標(biāo)。CAR的基礎(chǔ)設(shè)計中包括一個腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)結(jié)合區(qū)(通常來源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scFV段)，一個胞外鉸鏈區(qū)，一個跨膜區(qū)和一個胞內(nèi)信號區(qū)。目標(biāo)抗原的選擇對于CAR的特異性、有效性以及基因改造T細(xì)胞自身的安全性來講都是關(guān)鍵的決定因素。

隨著嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)技術(shù)的不斷發(fā)展，目前CAR-T主要可劃分為四代。

第一代CAR-T細(xì)胞由胞外結(jié)合區(qū)-單鏈抗體(single chain fragment variable，scFV)、跨膜區(qū)(transmembrane region，TM)和胞內(nèi)信號區(qū)-免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM)組成，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接：scFv-TM-CD3ζ。第一代CAR雖然能夠看到一些特異性的細(xì)胞毒性，但2006年對其進(jìn)行臨床試驗總結(jié)的時候卻發(fā)現(xiàn)療效差強人意。究其原因是因為第一代CAR-T細(xì)胞在病人體內(nèi)很快就會耗竭，其持久性很差，以至于CAR-T細(xì)胞還沒有來得及接觸到大量的腫瘤細(xì)胞時就已經(jīng)凋亡了該種CAR-T細(xì)胞可以激發(fā)抗腫瘤的細(xì)胞毒性效應(yīng)，但是細(xì)胞因子分泌比較少，但其在體內(nèi)的存活期較短不能激發(fā)持久的抗腫瘤效應(yīng)[Cancer Res 2007，67(22)：11029-11036]。

第二代CAR-T細(xì)胞優(yōu)化CAR設(shè)計中T細(xì)胞活化信號區(qū)仍然是研究的熱點。T細(xì)胞的完全活化有賴于雙信號和細(xì)胞因子的作用。其中第一信號為特異性信號，由TCR識別抗原遞呈細(xì)胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物所啟動；第二信號為協(xié)同刺激信號。早在1998年就出現(xiàn)了第二代CAR[J Immunol.1998；161(6)：2791-7]。第2代CAR在胞內(nèi)信號肽區(qū)添加了一個協(xié)同刺激分子，即把協(xié)同刺激信號組裝到CAR里面，能夠更好的為CAR-T細(xì)胞提供活化信號，這樣CAR識別腫瘤細(xì)胞后能夠同時活化協(xié)同刺激分子和胞內(nèi)信號，實現(xiàn)雙重活化，能明顯提高T細(xì)胞增殖分泌能力和抗腫瘤效應(yīng)。第一個被詳細(xì)研究的T細(xì)胞共刺激信號受體是CD28，它能夠與靶細(xì)胞表面的B7家族成員結(jié)合。CD28的共刺激能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，IL-2的合成和表達(dá)以及增強T細(xì)胞抵抗凋亡的能力。隨后又出現(xiàn)了CD134(OX40)和41BB(4-1BB)等共刺激分子，以提高T細(xì)胞的細(xì)胞毒性、增殖活性，維持T細(xì)胞應(yīng)答，延長T細(xì)胞存活時間等。這樣的第二代CAR在隨后的臨床試驗中產(chǎn)生了意想不到的效果，從2010年起基于第二代CAR的臨床報道屢次引發(fā)震動，特別是對于復(fù)發(fā)性、難治性的ALL病人，其完全緩解率高達(dá)90％以上。