[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)肝素前體的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611149201.3
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN106754598B
• 公開（公告）日: 2020-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 康振;陳堅;堵國成;張琳培;王浩;周正雄
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P19/26;A61K31/727;A61P7/02;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)肝素前體的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在產(chǎn)肝素前體的枯草芽孢桿菌中，共表達(dá)了UDP?GlcUA途徑和UDP?GlcNAc途徑中的關(guān)鍵酶基因，獲得了肝素前體產(chǎn)量及分子量均增大的重組菌株。當(dāng)共表達(dá)tuaD，gtaB，glmU，glmM和glmS基因，搖瓶中肝素前體產(chǎn)量提高至2.89g/L，分子量為75.90kDa。通過在3L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，肝素前體的產(chǎn)量最終積累到7.25g/L，分子量為46.66kDa。本發(fā)明為工業(yè)化生產(chǎn)肝素奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)肝素前體的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

肝素(Heparin)和硫酸乙酰肝素(HS)屬于一類高度硫酸化的糖胺聚糖(GAGs)，糖胺聚糖是一類由重復(fù)的二糖單元組成的不分支的帶負(fù)電荷的多糖，由于其獨特的生理功能，糖胺聚糖組成了一類具有巨大治療應(yīng)用潛力的化合物。肝素作為一種抗凝血和抗血栓藥物，在深部靜脈血栓形成、腎透析和留置導(dǎo)管分流術(shù)、及術(shù)后血栓控制等醫(yī)療措施中使用。同時還具有抗血脂，抗炎、抗腫瘤、抑制細(xì)菌粘附等作用，自1918年被發(fā)現(xiàn)后被廣泛應(yīng)用于臨床作為抗凝血藥物。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物活性多樣等特點，研發(fā)以肝素和硫酸乙酰肝素為骨架的新藥已成為近年來多糖藥物研究的熱點。

肝素主要通過動物提取法獲得，然而該方法存在種間疾病感染和過硫酸軟骨素污染等風(fēng)險，且提取過程往往造成環(huán)境污染。另外，通過化學(xué)法也可從頭合成低分子量的肝素，但因原料昂貴、步驟繁多和產(chǎn)量極低等缺點難以進(jìn)行大規(guī)模制備。近年來，以肝素前體為合成起點進(jìn)行硫酸化的化學(xué)酶法逐漸受到研究者的重視，因此，在微生物中實現(xiàn)肝素前體的高產(chǎn)成為了重要環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)肝素前體的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌B.subtilis 168基因組整合表達(dá)KfiC和KfiA基因的基礎(chǔ)上，以pP43NMK為表達(dá)載體共表達(dá)肝素前體合成途徑的關(guān)鍵酶基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述共表達(dá)是指共表達(dá)UDP-GlcUA途徑的關(guān)鍵酶基因pgcA、gtaB、tuaD，或共表達(dá)UDP-GlcNAc途徑的關(guān)鍵酶基因glmS、glmM、glmU。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述共表達(dá)是指組合共表達(dá)，所述組合共表達(dá)是共表達(dá)tuaD和glmU，或共表達(dá)tuaD、glmU、gtaB、glmM、glmS。。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，是以整合共表達(dá)KfiC和KfiA基因的B.subtilis 168為宿主，以pP43NMK為表達(dá)載體共表達(dá)肝素前體合成途徑的關(guān)鍵酶基因；所述共表達(dá)是指共表達(dá)UDP-GlcUA途徑的關(guān)鍵酶基因pgcA、gtaB、tuaD，或共表達(dá)UDP-GlcNAc途徑的關(guān)鍵酶基因glmS、glmM、glmU。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述共表達(dá)是指組合共表達(dá)，所述組合共表達(dá)是共表達(dá)tuaD和glmU，或共表達(dá)tuaD，gtaB，glmU，glmM和glmS。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)肝素前體的方法，所述方法是將所述重組菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)24～60h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖為碳源。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成為分：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，3.9g/L硫酸鉀，1.5g/L硫酸鎂，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.5-7.5。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成為分：20g/L酵母粉，15g/L蔗糖，3.9g/L硫酸鉀，1.5g/L硫酸鎂，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.5-7.5。

本發(fā)明還提供所述重組枯草芽孢桿菌在醫(yī)藥、保健品領(lǐng)域的應(yīng)用，所述應(yīng)用具體是制備含肝素的藥品、醫(yī)藥配制品。