[發明專利]擴增兜蘭屬B類MADS-box基因的引物

有效

• 申請號: 201611147999.8
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN106755383B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 賈瑞冬;周妍慧;葛紅;楊樹華;趙鑫;徐玉鳳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京市鑄成律師事務所 11313
• 代理人: 王建秀;郝文博

1.用于分離亨利兜蘭B類MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的引物組，包括下列5’→3’引物的組合：

和

2.一種試劑盒，其中所述試劑盒包括如權利要求1所述的引物組。

3.如權利要求1所述的引物組在制備用于通過巢式PCR方法分離亨利兜蘭B類MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的試劑盒中的用途。

4.一種通過巢式PCR方法分離亨利兜蘭B類MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的方法，所述方法使用如權利要求1所述的引物組。

5.如權利要求4所述的方法，所述方法包括如下步驟：

1).提取亨利兜蘭植物的總RNA；

2).采用3’RACE技術擴增得到目的基因完整的3’序列，包括：

2-a).利用總RNA為模板進行第一鏈cDNA的合成，其中初始反應體系包括：1μl濃度為100pmol/μl的Oligo(dT)₁₇、1μl濃度為10mM的dNTP和11μl mRNA；

2-b).利用步驟2-a)所得的cDNA為模板，采用巢式PCR的方法，進行3'RACE第一輪PCR反應和3'RACE第二輪PCR反應，以擴增目的基因片段，其中涉及的引物如下：

其中，3'RACE第一輪PCR反應體系如下：

其中F1分別是上述AP3A1_F1、AP3A2_F1、AP3B1_F1、AP3B2_F1或PI_F1，

其中，3'RACE第二輪PCR反應體系如下：

其中F2分別是上述AP3A1_F2、AP3A2_F2、AP3B1_F2、AP3B2_F2或PI_F2；

3).采用5’RACE技術擴增得到目的基因完整的5’序列，包括

3-a).使步驟1)的RNA脫磷酸、去帽、并進行連接反應：

3-b).利用步驟3-a)得到的已進行連接反應的RNA為模板，進行第一鏈cDNA的合成，其中初始反應體系包括：1μl濃度為50μM的GeneRacer Oligo dT引物、1μl濃度為10mM的dNTPMix和1μl DEPC H₂O；

3-c).利用步驟3-b)所得的cDNA為模板，采用巢式PCR的方法，進行5'RACE第一輪PCR反應和5'RACE第二輪PCR反應，以擴增目的基因片段，其中涉及的引物如下：

其中，5'RACE第一輪PCR反應體系如下：

其中R1分別是上述AP3A1_R1、AP3A2_R1、AP3B1_R1、AP3B2_R1或PI_R1，

其中，5'RACE第二輪PCR反應體系如下：

其中R2分別是上述AP3A1_R2、AP3A2_R2、AP3B1_R2、AP3B2_R2或PI_R2；和

4).回收上述步驟2)和3)所得的PCR擴增產物，測序后進行序列分析并將同一基因的相應5’序列和3’序列拼接，得到完整的基因序列。

6.如權利要求5所述的方法，還包括將所得的完整的基因序列與已知的蘭科其他的相應B類基因的序列進行序列比對的步驟，以確定所得完整的基因序列是否是目的基因序列。

7.一種開發亨利兜蘭B類MADS-box基因PahePI、PaheAP3A1、PaheAP3A2、PaheAP3B1、PaheAP3B2的引物的方法，其中所述引物選自如權利要求1所述的引物組。