[發(fā)明專利]表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S600基因的重組乳酸乳球菌及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611145620.X
• 申請(qǐng)日: 2016-12-13
• 公開（公告）號(hào): CN106834310A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金梅林;蔡承志;康超;吳超;孫小美
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/50
• 分類號(hào): C12N15/50;C07K14/17;C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;A61K39/225;A61P31/14;C12R1/46
• 代理公司: 武漢開元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司42104
• 代理人: 王和平,馮超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及家畜基因工程疫苗領(lǐng)域，具體地指一種表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S₆₀₀基因的重組乳酸乳球菌及應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of pigs，TGE)是一種由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of pigs，TGEV)引起的一種以嘔吐、脫水、嚴(yán)重腹瀉為主要特征的急性、高度接觸性傳染病。各種年齡和品種的豬對(duì)TGEV均易感，2周齡內(nèi)的仔豬死亡率高達(dá)100％，雖然成年豬感染TGEV一般可以耐受，但是出現(xiàn)掉膘、降低飼料報(bào)酬，以致浪費(fèi)人力、物力和財(cái)力，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。

針對(duì)TGEV的防制目前主要依靠疫苗接種，而當(dāng)前所使用的組織或細(xì)胞滅活苗和弱毒苗不同程度上存在各種缺陷，包括免疫效果不夠理想、成本高、重組復(fù)活或排毒散毒等現(xiàn)象。特別是近年來流行的病毒在毒力和生物學(xué)特性存在變異，傳統(tǒng)疫苗往往達(dá)不到抵抗自然流行毒株攻擊的效果。

研究資料表明，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的S基因編碼的纖突糖蛋白(S蛋白)是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的結(jié)構(gòu)蛋白。S蛋白上共有4個(gè)中和位點(diǎn)：A位點(diǎn)(538-591aa)、B位點(diǎn)(97-144aa)、C位點(diǎn)(48-52aa)、D位點(diǎn)(378-395aa)，其中A、D位點(diǎn)在誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用，一旦缺失將不能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。國(guó)外有專家學(xué)者通過放射免疫分析進(jìn)一步研究證實(shí)，S糖蛋白攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，介導(dǎo)細(xì)胞吸附、膜融合及不依賴補(bǔ)體的中和抗體產(chǎn)生并提供免疫保護(hù)作用，S糖蛋白決定病毒的毒力及組織嗜性。

動(dòng)物感染豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)后前期主要通過粘膜免疫的途徑清除病原體，粘膜免疫是區(qū)別于全身免疫的局部免疫，是指動(dòng)物機(jī)體與外界相通的腔道(消化道、呼氣道及泌尿生殖道等)粘膜表面的免疫，粘膜不僅是動(dòng)物機(jī)體與外界環(huán)境的防御屏障，同時(shí)還兼有明顯的體液及細(xì)胞免疫功能，局部抗原刺激更能有效地激發(fā)機(jī)體粘膜分泌大量的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，作為粘膜免疫系統(tǒng)或局部免疫系統(tǒng)，特別在呼吸道、消化道、泌尿生殖道及乳腺等粘膜內(nèi)所發(fā)生的免疫活性成份，對(duì)機(jī)體感染的防御作用越來越引起人們的重視，粘膜免疫系統(tǒng)在抵抗感染方面起著極其重要的作用，粘膜表面與外界抗原直接接觸，是機(jī)體抗感染的第一道防線，研究粘膜免疫無論在理論上還是在生產(chǎn)實(shí)踐上均具有重要而深遠(yuǎn)的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒S₆₀₀基因的重組乳酸乳球菌及應(yīng)用。其應(yīng)用乳酸乳球菌MG1363的組成型表達(dá)載體pMG36e進(jìn)行表達(dá)，乳酸乳球菌是公認(rèn)的安全級(jí)(GARS)微生物，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)具有有益的調(diào)節(jié)作用，乳酸菌組成型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白不需要誘導(dǎo)劑，在自身生長(zhǎng)分裂過程中合成外源目的蛋白，可消除產(chǎn)品中誘導(dǎo)劑帶來的毒性及副作用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種密碼子優(yōu)化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的衣殼蛋白S₆₀₀基因，該S₆₀₀基因表達(dá)的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2具有ABCD四個(gè)抗原中和位點(diǎn)，可有效刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；所述重組衣殼蛋白S₆₀₀基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。該基因表達(dá)的蛋白如SEQ IDNO.2所示。

該重組衣殼蛋白S₆₀₀基因是以SEQ IDNO.3所示的表達(dá)靶基因?yàn)閰⒄眨缓蟾鶕?jù)乳酸乳球菌MG1363密碼子的偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化處理得到，該表達(dá)靶基因來自于NCBI(ACESSION：M94099，GI：333333)公開的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的S蛋白基因序列，由于ABCD四個(gè)中和位點(diǎn)位于1-600位氨基酸殘基內(nèi)，具體來說A中和位點(diǎn)位于TGEV S基因的第1614-1773bp，B中和位點(diǎn)位于TGEV S基因的第291-432bp，C中和位點(diǎn)位于TGEV S基因的第144-156bp，D中和位點(diǎn)位于TGEV S基因的第1134-1185bp，故選取TGEV S基因的第1-1800bp核苷酸序列作為目標(biāo)基因序列并命名為TGEV-S₆₀₀。