[發明專利]表達豬傳染性胃腸炎病毒S600基因的重組乳酸乳球菌及應用

在審

• 申請號: 201611145620.X
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN106834310A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 金梅林;蔡承志;康超;吳超;孫小美
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/50
• 分類號: C12N15/50;C07K14/17;C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;A61K39/225;A61P31/14;C12R1/46
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司42104
• 代理人: 王和平,馮超

1.一種密碼子優化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的重組衣殼蛋白S₆₀₀基因，其特征在于：所述重組衣殼蛋白S₆₀₀基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.組成型重組表達載體TGEV-S₆₀₀-pMG36e，其特征在于：所述組成型重組表達載體TGEV-S₆₀₀-pMG36e是在表達載體pMG36e的SalⅠ和KpnⅠ引物間插入重組衣殼蛋白S₆₀₀基因構建而成，其中，衣殼蛋白S₆₀₀基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一種權利要求2所述組成型重組表達載體TGEV-S₆₀₀-pMG36e的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)根據密碼子優化合成的衣殼蛋白S₆₀₀基因的核苷酸序列和pMG36e載體多克隆位點設計一對引物，上游和下游分別為：

其中，上述引物分別含有SalⅠ和KpnⅠ的限制性內切酶，且在S₆₀₀-P2的限制性內切酶KpnⅠ結尾加一個終止密碼子TAA；

2)擴增含有上述限制性內切酶的衣殼蛋白S₆₀₀基因片段；

以合成的基因作為模板進行Prime-STAR擴增，

Prime-STAR擴增體系：

Prime-STAR擴增反應程序：

預變性：98℃，2min；變性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，2min；后延伸：72℃，10min；cycle：30；

純化的含有上述限制性內切酶的衣殼蛋白S基因片段；

3)上述PCR得到的衣殼蛋白S₆₀₀基因片段和表達載體pMG36e的雙酶切

用SalⅠ和KpnⅠ兩種限制性內切酶分別同時酶切衣殼蛋白S₆₀₀基因片段和表達載體pMG36e，酶切反應體系如下：

純化回收得到線性化的衣殼蛋白S₆₀₀基因片段和線性化的表達載體pMG36e；

4)重組表達載體TGEV-S₆₀₀-pMG36e

將純化回收得到線性化的衣殼蛋白S₆₀₀基因片段和線性化的表達載體pMG36e用T4 DNA連接酶連接，得到重組表達載體TGEV-S₆₀₀-pMG36e。

4.一種表達豬傳染性胃腸炎病毒S₆₀₀基因的重組乳酸乳球菌TGEV-S₆₀₀-MG1363，其特征在于：所述重組乳酸乳球菌TGEV-S₆₀₀-MG1363的基因組中含有權利要求2所述重組表達載體TGEV-S₆₀₀-pMG36e。