[發明專利]一種具有殺菌活性的仿刺參肽聚糖識別蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201611143071.2
• 申請日: 2016-12-07
• 公開（公告）號: CN106749588B
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 孔令明;叢海燕
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/70;A61K38/17;A61P31/04;A23K20/147
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 趙妍

本發明屬于分子生物學領域和基因工程技術領域，具體公開了一種具有殺菌活性的仿刺參肽聚糖識別蛋白及其制備方法和應用。本發明利用體外重組表達技術首次獲得了仿刺參肽聚糖識別蛋白AJ?PGRP，仿刺參肽聚糖識別蛋白(AJ?PGRP)為序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。該重組蛋白對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有凝集作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、燦爛弧菌和枯草芽孢桿菌具有抑制作用，在開發新型廣譜抗菌藥物開發和飼料添加劑等方面具有潛在應用價值。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域和基因工程技術領域，具體涉及一種具有殺菌活性的仿刺參肽聚糖識別蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

仿刺參(Apostichopus japonicus)屬棘皮動物門(Echinodermata)，海參綱(Holothuroidea)，楯手目(Aspidochirotida)，刺參科(Stichopodidae)，主要分布在北緯35°～44°的西北太平洋沿岸，山東、遼寧和河北是我國仿刺參的主要養殖區。仿刺參位列“海八珍”之首，具有很高的營養價值和醫藥價值。近年來，隨著人們社會生活條件的提高和健康意識的增強，仿刺參市場需求量逐年增加，不斷刺激養殖規模加大，仿刺參因此成為我國水產養殖業中單一產值最大的養殖品種。但是養殖過程中遇到的病害問題一直是困擾產業進一步發展的重要制約因素。利用生物技術的手段進行疾病防治越來越引起人們的重視。

肽聚糖(Peptidoglycan)是存在于革蘭氏陽性和陰性細菌細胞壁中的一種復合糖類。主鏈是β-1,4-糖苷鍵連接的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸交替的雜多糖。肽聚糖是許多細菌細胞壁的主要成分，尤其在革蘭氏陽性細菌中，其所含的肽聚糖占細胞壁干重的50～80％。

肽聚糖識別蛋白(Peptidoglycan recognition protein,PGRP)是識別和結合肽聚糖的模式識別分子。通過識別入侵菌原菌的肽聚糖，進而激活Toll信號通路(Toll-likereceptors)途徑和免疫缺陷(Immune Deficiency,IMD)途徑等免疫信號通路并介導吞噬作用，因此在抵抗病原入侵的過程中發揮著重要的作用。

1996年，Yoshida H首次在家蠶血淋巴中發現肽聚糖識別蛋白，隨后在魚類、軟件動物和一些脊椎動物中也相繼被發現。根據它們的序列結構特點，肽聚糖識別蛋白可以分為兩個亞型，即長型肽聚糖識別蛋白(PGRP-L)和短型肽聚糖識別蛋白(PGRP-S)。而目前對于仿刺參肽聚糖識別蛋白尚未有報道。發掘仿刺參的功能基因，制備生物抗菌藥物，有助于解決當前養殖中抗生素抗藥性問題，因此具有十分重要的理論和現實意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本申請提供一種具有殺菌活性的仿刺參肽聚糖識別蛋白的制備及應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種具有殺菌活性的仿刺參肽聚糖識別蛋白，仿刺參肽聚糖識別蛋白(AJ-PGRP)為序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。

肽聚糖識別蛋白(AJ-PGRP)的制備方法為：

(1)以仿刺參cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增，待用；

(2)PCR產物經純化后與載體pEASY-E1載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌，測序鑒定重組子；

(3)將上述表達載體pEASY-AJ-PGRP轉入Trans BL21(DE3)化學感受態細胞，篩選轉化子，將轉化子接種于含有氨芐青霉素的LB培養基中，用IPTG誘導表達，而后用親和層析柱純化重組蛋白，即得到序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列的肽聚糖識別蛋白AJ-PGRP。

所述引物分別為：F1：5’-ATGGATGAACCGCCGCGTGCCTT-3’，R1:5’-ATGGTGATGTATAATTTCTTG-3’。