[發明專利]一種創制耐熱芥藍種質的方法

有效

• 申請號: 201611139630.2
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN106755070B
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 鄒麗芳;雷建軍;陳長明;陳國菊;曹必好
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林瑞云

1.一種創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.以矮腳香菇芥藍DNA為模板，構建含有如SEQ ID NO:1所示MBF1c基因的重組超表達載體；

S2.將S1得到的重組超表達載體轉化農桿菌，得到重組農桿菌；

S3.用重組農桿菌轉染芥藍外植體，經培養獲得轉化植株，篩選得到耐熱芥藍。

2.根據權利要求1所述創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，所述超表達載體的構建方法為：

S11.利用超表達引物擴增得到MBF1c基因的ORF全長；

S12.將S11克隆的片段連接到pBE-GFP載體，制得MBF1c基因的重組超表達載體。

3.根據權利要求2所述創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO:3～4所示，分別為：

MBF1-yxb–F:CGCGGGCCCGGGATCCATGCCGAGCAGAT；

MBF1-yxb–R:GGCGACCGGTGGATCCTTGACATGTTT。

4.根據權利要求2所述創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，所述連接方法采用infusion技術。

5.根據權利要求1所述創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，在農桿菌轉染芥藍外植體前，將所述芥藍外植體放入分化培養基中，于25℃黑暗預培養2d。

6.根據權利要求1所述創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，所述農桿菌轉染芥藍外植體后培養步驟如下：

S31.外植體侵染后接種至分化培養基中，在25±1℃條件下恒溫黑暗培養2d；

S32.抑菌培養：接種于抑菌培養基中25℃培養3～5d；

S33.篩選培養：接種于卡那霉素篩選培養基上，每兩周繼代一次，繼代2～3次，直到只有少許外植體能在篩選培養基上長出抗性芽，而大部分外植體在含卡那霉素的篩選培養基上褪綠，變黃白化為止；

S34.生根培養：當分化的不定芽伸長至1.5～2.5cm時，將其自基部切下，接種于生根培養基中誘導其生根，煉苗2～3d，移栽獲得抗性芥藍苗。

7.根據權利要求6所述創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，所述重組農桿菌轉染芥藍外植體時的OD600為0.4～0.8，轉染時間為9min。

8.根據權利要求6所述創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，所述卡那霉素濃度為10mg/L。

9.根據權利要求6所述創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，所述芥藍外植體為無菌帶柄子葉和下胚軸。

10.根據權利要求9所述創制耐熱芥藍種質的方法，其特征在于，所述無菌帶柄子葉和下胚軸獲得方法為：將芥藍種子經75％酒精、2％次氯酸鈉消毒后，用無菌水浸泡，倒去無菌水，吸去種子表面的水分，在25～28℃黑暗條件下培養2d，然后把種子取出放到25℃、光照2000lx 14h/d培養條件下培養，待芥藍小苗子葉展平時切下子葉和下胚軸即可。