[發明專利]一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法

有效

• 申請號: 201611138265.3
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN106755374B
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 王素華;閆寶龍;帥江冰;吳紹強
• 申請（專利權）人: 溫州出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 溫州金甌專利事務所(普通合伙)33237
• 代理人: 王堅強

技術領域

本發明具體涉及生物學技術領域，具體涉及一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法。

背景技術

蜱類是一種專性、非永久性寄生于陸生脊椎動物的醫學節肢動物，可通過直接叮咬和釋放毒素或攜帶病原體對宿主造成傷害。在進出境口岸蜱種類的調查中，對蜱蟲的鑒定及進化分型具有重要意義。目前，我國對于蜱種的鑒定主要依靠形態學方法，還沒有簡單、穩定的分子生物學手段。

發明內容

為了解決現有技術的缺陷及不足，本發明提供了一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法，能夠在低DNA模板濃度下快速、穩定的鑒定蜱蟲的種類。

本發明采用的技術解決方案是：一種蜱蟲巢式PCR特異性引物，包括設計的兩對特異性引物，具體為：

T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；

T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；

T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；

T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。

一種蜱蟲巢式PCR鑒定方法，包括以下步驟：

(1)將需要檢測的蜱蟲樣品進行形態學上初步分型；

(2)將經過形態學初步分型鑒定處理后的蜱蟲樣品，每種各取一只，進行基因組提取DNA，蜱蟲樣品無需RNA酶處理；

(3)以蜱蟲樣品基因組DNA為模板，以所述的T18sF1+T18sR1為第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、雙蒸水，進行第一輪PCR；

(4)以第一輪PCR產物DNA為模板，分別以所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1為第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、雙蒸水，進行第二輪PCR；

(5)取第二輪PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；

(6)將第二輪PCR產物進行序列測定；

(7)根據NCBI數據庫中記載的蜱蟲18s rRNA基因序列，進行系統進化分析，最終得出蜱蟲樣品鑒定結果。

所述的步驟(3)中的第一輪PCR反應條件為：預熱95℃，5min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，共10個循環；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。

所述的步驟(4)中的第二輪PCR反應條件為：預熱95℃，5min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，共25個循環；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。

所述的步驟(3)中蜱蟲樣品基因組DNA量為2μl，第一套引物中T18sF1+T18sR1各為1μl，LAtaq酶為0.25μl，dNTP為2μl，10×Loading buffer為2.5μl，雙蒸水16.25μl。

所述的步驟(4)中第一輪PCR產物DNA量為1μl，第二套引物T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1各為1μl，LAtaq酶為0.25μl，dNTP為2μl，10×Loading buffer為2.5μl，雙蒸水17.25μl。

所述的步驟(5)中第二輪PCR產物量為2μl。

本發明的有益效果是：本發明提供了一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法，采用更為敏感的巢式PCR方法，單蜱蟲甚至蜱蟲的部分組織器官提取的微量基因組DNA即可作為模板進行鑒定，通過在基因水平上進行蜱蟲的分型、系統進化分析，本發明巢式PCR方法第一輪只需10個循環，第二輪需25個循環，縮短了簡單的兩輪普通PCR所需時間。

附圖說明

圖1為18s rRNA巢式PCR方法克隆示意圖。

圖2為溫州口岸進口生牛皮中截獲蜱蟲形態學觀察。

圖3為兩輪輪PCR產物分別經瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定結果。

圖4為根據18s rRNA基因序列對蜱蟲進行系統進化分析結果。

具體實施方式

根據蜱蟲18s rRNA序列保守區設計兩對特異性引物

T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；

T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；

T 18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；