[發明專利]一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法

有效

• 申請號: 201611138265.3
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN106755374B
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 王素華;閆寶龍;帥江冰;吳紹強
• 申請（專利權）人: 溫州出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 溫州金甌專利事務所(普通合伙)33237
• 代理人: 王堅強

1.一種蜱蟲巢式PCR特異性引物，其特征在于，包括設計的兩對特異性引物，具體為：

T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；

T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；

T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；

T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。

2.一種采用權利要求1所述的特異性引物的蜱蟲巢式PCR鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將需要檢測的蜱蟲樣品進行形態學上初步分型；

(2)將經過形態學初步分型鑒定處理后的蜱蟲樣品，每種各取一只，進行基因組提取DNA，蜱蟲樣品無需RNA酶處理；

(3)以蜱蟲樣品基因組DNA為模板，以權利要求1中所述的T18sF1+T18sR1為第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、雙蒸水，進行第一輪PCR；

(4)以第一輪PCR產物DNA為模板，分別以權利要求1中所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1為第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、雙蒸水，進行第二輪PCR；

(5)取第二輪PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；

(6)將第二輪PCR產物進行序列測定；

(7)根據NCBI數據庫中記載的蜱蟲18s rRNA基因序列，進行系統進化分析，最終得出蜱蟲樣品鑒定結果。

3.根據權利要求2所述的蜱蟲巢式PCR鑒定方法，其特征在于，所述的步驟(3)中的第一輪PCR反應條件為：

95℃預熱5min；

94℃保持1min，60℃保持1min，72℃保持2min，該步驟進行共10個循環；

末次延伸至72℃，保持10min，4℃保存10min。

4.根據權利要求2所述的蜱蟲巢式PCR鑒定方法，其特征在于，所述的步驟(4)中的第二輪PCR反應條件為：

95℃，預熱5min；

94℃保持1min，60℃保持1min，72℃保持2min，該步驟進行共25個循環；

末次延伸至72℃，保持10min，4℃保存10min。

5.根據權利要求2所述的蜱蟲巢式PCR鑒定方法，其特征在于，所述的步驟(3)中蜱蟲樣品基因組DNA量為2μl，第一套引物中T18sF1+T18sR1各為1μl，LAtaq酶為0.25μl，dNTP為2μl，10×Loadingbuffer為2.5μl，雙蒸水16.25μl。

6.根據權利要求2所述的蜱蟲巢式PCR鑒定方法，其特征在于，所述的步驟(4)中第一輪PCR產物DNA量為1μl，第二套引物T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1各為1μl，LAtaq酶為0.25μl，dNTP為2μl，10×Loading buffer為2.5μl，雙蒸水17.25μl。

7.根據權利要求2所述的蜱蟲巢式PCR鑒定方法，其特征在于，所述的步驟(5)中第二輪PCR產物量為2μl。