[發(fā)明專利]一種基于蛋白質(zhì)組學分析碳納米管加固蠶絲對蠶絲蛋白氨基酸序列影響的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611136630.7
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN106596820B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭志勤;古錦翠;王秉;萬軍民;胡智文
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 浙江納祺律師事務(wù)所 33257
• 代理人: 鄭滿玉

1.一種基于蛋白質(zhì)組學分析碳納米管加固蠶絲對蠶絲蛋白氨基酸序列影響的方法，其特征在于采用如下步驟：

a)選取一份來自同一母體的蠶卵在相同條件下孵育，待蠶破殼長大之后，將其等量隨機分為A，B兩組；

b)在A組蠶幼蟲所食桑葉上噴淋含有碳納米管的水溶液0.5～2.5mL，B組蠶幼蟲所食桑葉不做處理，其他生長條件保持相同；

c)待幼蟲吐絲結(jié)繭之后收集兩組蠶絲分別以1:100的浴比在質(zhì)量分數(shù)為0.5％的Na₂CO₃水溶液和質(zhì)量分數(shù)為0.5～1.5％的SDS這兩者的混合溶液中沸煮30min進行脫膠，共脫膠兩次，1h之后，將溶液和絲素分離，絲素用去離子水沖洗并在50～60℃的烘箱中烘干；

d)將脫膠烘干的絲素纖維放入預先配好的CaCl₂:H₂O:乙醇為1:8:2的混合溶液中，浴比為1：25，加熱到93～97℃蒸煮10～20min，獲得蠶絲溶液，冷卻過濾之后用截留分子量為8000～14000的透析袋透析，透析開始的12h內(nèi)每隔2h左右換一次水，12h后每隔4h換一次水，24h后每隔8h換一次水，72h后得到絲素蛋白溶液,濃縮處理；

e)取濃縮之后的溶液加入質(zhì)量分數(shù)為1.5～2％的二硫蘇糖醇溶液2～3mL于40～50℃下保持15～20min,待冷卻至室溫加入質(zhì)量分數(shù)為2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液4～5mL，黑暗環(huán)境下保持15～20min后加入50～80μL的胰凝乳蛋白酶溶液，然后用甲酸溶液稀釋；

f)采用HPLC～MS/MS對其進行質(zhì)譜分析，將結(jié)果與氨基酸序列數(shù)據(jù)庫進行對比，比較A，B兩組實驗結(jié)果中的蠶絲蛋白氨基酸序列，B組與氨基酸序列數(shù)據(jù)庫對比差別不大，分析A組，如果A組中氨基酸序列與B組存在明顯的序列差異說明蠶絲加固對蠶絲蛋白的序列結(jié)構(gòu)有影響，如果A組氨基酸序列與B組無明顯差異說明蠶絲加固與氨基酸序列結(jié)構(gòu)無關(guān)。

2.一種基于蛋白質(zhì)組學分析碳納米管加固蠶絲對蠶絲蛋白氨基酸序列影響的方法，其特征在于采用如下步驟：

a)選取一份來自同一母體的蠶卵在相同條件下孵育，待蠶破殼長大之后，將其等量隨機分為A,B兩組；

b)在A組蠶幼蟲所食桑葉上噴淋含有碳納米管的水溶液1.5mL，B組蠶幼蟲所食桑葉不做處理，其他生長條件保持相同；

c)待幼蟲吐絲結(jié)繭之后收集兩組蠶絲分別以1:100的浴比在質(zhì)量分數(shù)為0.5％的Na₂CO₃水溶液和質(zhì)量分數(shù)為1％的SDS這兩者的混合溶液中沸煮30min進行脫膠，共脫膠兩次,1h之后，將溶液和絲素分離，絲素用去離子水沖洗并在55℃的烘箱中烘干；

d)將脫膠烘干的絲素纖維放入預先配好的CaCl₂:H₂O:乙醇為1:8:2的混合溶液中，浴比為1：25，加熱到95℃蒸煮15min,獲得蠶絲溶液，冷卻過濾之后用截留分子量為11000的透析袋透析，透析開始的12h內(nèi)每隔2h左右換一次水，12h后每隔4h換一次水，24h后每隔8h換一次水，72h后得到絲素蛋白溶液,濃縮處理；

e)取濃縮之后的溶液加入質(zhì)量分數(shù)為1.7％的二硫蘇糖醇溶液2.5mL于45℃下保持17min,待冷卻至室溫加入質(zhì)量分數(shù)為2.5％的碘乙酰胺溶液4.5mL，黑暗環(huán)境下保持17min后加入65μL的胰凝乳蛋白酶溶液,然后用甲酸溶液稀釋；

f)采用HPLC～MS/MS對其進行質(zhì)譜分析，將結(jié)果與氨基酸序列數(shù)據(jù)庫進行對比,比較A,B兩組實驗結(jié)果中的蠶絲蛋白氨基酸序列，B組與氨基酸序列數(shù)據(jù)庫對比差別不大，分析A組，如果A組中氨基酸序列與B組存在明顯的序列差異說明蠶絲加固對蠶絲蛋白的序列結(jié)構(gòu)有影響，如果A組氨基酸序列與B組無明顯差異說明蠶絲加固與氨基酸序列結(jié)構(gòu)無關(guān)。