[發(fā)明專利]一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)測定古代牛毛微痕跡的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611136550.1
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN106596970B
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭志勤;古錦翠;王秉;萬軍民;胡智文
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N27/447;G01N1/28
• 代理公司: 浙江納祺律師事務(wù)所 33257
• 代理人: 鄭滿玉

1.一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)測定古代牛毛微痕跡的方法，其特征在于采用步驟如下：

(A)稱取古代牛毛微痕跡土樣，表土層土樣和土層土樣各25～30g，用研缽分別研磨三組樣品，標(biāo)記為A、B、C三組；

(B)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5～7％的過一硫酸氫鉀復(fù)合鹽水溶液3000～5400mL，用飽和氫氧化鈉對該溶液進行調(diào)節(jié)，以使溶液的pH為4～6，等量分為三組備用；

(C)將步驟(A)中的三組樣品均按照1:40～60的比例分別放入步驟(B)配好的溶液中，然后在30～50℃下攪拌40～50min，三組實驗在相同條件下獨立操作；

(D)對經(jīng)步驟(C)最終得到的三組樣品使用高速冷凍離心機進行離心除去懸浮顆粒，轉(zhuǎn)速控制在4000～5000r/min，溫度為10～30℃，時間為25～30min；

(E)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4～6％的亞硫酸氫鈉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2～5％的尿素以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5～1.5％的十二烷基苯磺酸鈉進行混合以形成每組樣品50～100倍質(zhì)量的混合溶液；

(F)將步驟(E)中形成的混合溶液分別加入步驟(D)中離心完成后的三組樣品中，并在90～110℃下反應(yīng)3～5h后完成過濾；

(G)對經(jīng)步驟(F)后的三組樣品使用截留分子量為8000～14000的透析袋透析，透析開始后的前10～12h，每隔1.5～2.5h換一次水，10～12h后每隔6～8h換一次水，70～72h后將得到的液體裝入濃縮管中真空濃縮15～20min，備用；

(H)通過重泡漲上樣法將步驟(G)濃縮后的三組樣品分別用pH范圍為3.0～5.3的IPG膠條覆蓋，使用液體石蠟密封之后等電聚焦，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5～2％的二硫蘇糖醇溶液0.5～3.5mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液0.5～5.5mL，平衡緩沖液平衡15～20min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％的卡馬斯亮藍，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的乙醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的乙酸對膠條染色，觀察三組樣品的電泳圖像，如果A組電泳結(jié)果可以檢測到明顯的蛋白質(zhì)條帶而B，C組沒有檢測到，則說明土樣中不含有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)來源于古代牛毛微痕跡；

(I)將經(jīng)步驟(H)染色三組樣品的電泳條帶割下來分別裝入三個1.5mL離心管中，每管加入300～400μL水震蕩洗滌，重復(fù)一次后向每管中加入乙腈與碳酸氫銨溶液1:1混合的脫色液40～70μL，2～4min之后用去離子水終止反應(yīng)并重復(fù)洗滌一次，吸出多余的液體，然后將裝有膠粒的離心管開蓋置于真空濃縮儀中干燥；

(J)分別向步驟(I)所得的三組樣品離心管中加入胰凝乳蛋白酶1～2μg，完全蓋住膠粒冰浴40～50min使膠粒充分吸收酶解液溶脹然后置于25～35℃烘箱中孵育10～12h；

(K)將步驟(J)中的酶解液吸出，分別放到另外三個新的1～2mL離心管中，得到三組樣品的原液；

(L)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成10～30μL的混合液，將所述混合液分別加入到經(jīng)步驟(J)處理后的離心管中，振蕩洗滌15～25min形成三組樣品的第一新液，分別吸取同一組樣品中的第一新液與同一組樣品中的原液合并以獲得三組樣品的第二新液；

(M)向步驟(L)中的第二新液中再次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液10～30μL，振蕩洗滌5～15min，并超聲4～6min以獲得三組樣品的第三新液，分別吸取同一組樣品中的第三新液與同一組樣品中的第二新液合并以形成三組樣品的最終液體；

(N)將步驟(M)獲得的三組樣品的最終液體離心提純，離心管置于真空濃縮儀濃縮抽干，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05～0.15％的三氟乙酸水溶液于-10～-30℃凍存；

(O)將步驟(N)中形成的多肽混合溶液分別注入二氧化硅C18反向?qū)游雒毠苤校⒁?00～700nL/min的速度進行洗脫；

(P)將經(jīng)步驟(O)洗脫的三組樣品放入LTQ～Orbitrap XL質(zhì)譜儀，使用正離子模式，離子間分辨率為50000～70000，每次掃描取強度最高的4～6個母離子進行二級質(zhì)譜檢測；

(Q)對生物質(zhì)譜檢測的蛋白質(zhì)氨基酸序列進行分析，如果A組含有牛毛角蛋白的特征肽段則可判定A為古代牛毛微痕跡。

2.一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)測定古代牛毛微痕跡的方法，其特征在于采用步驟如下：

(A)稱取古代牛毛微痕跡土樣，表土層土樣和土層土樣各27g，用研缽分別研磨三組樣品，標(biāo)記為A、B、C三組；

(B)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6％的過一硫酸氫鉀復(fù)合鹽水溶液4200mL，用飽和氫氧化鈉對該溶液進行調(diào)節(jié)，以使溶液的pH為5，等量分為三組備用；

(C)將步驟(A)中的三組樣品均按照1:50的比例分別放入步驟(B)配好的溶液中，然后在40℃下攪拌45min，三組實驗在相同條件下獨立操作；

(D)對經(jīng)步驟(C)最終得到的三組樣品使用高速冷凍離心機進行離心除去懸浮顆粒，轉(zhuǎn)速控制在4500r/min，溫度為20℃，時間為27min；

(E)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的亞硫酸氫鈉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5％的尿素以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的十二烷基苯磺酸鈉進行混合以形成每組樣品75倍質(zhì)量的混合溶液；

(F)將步驟(E)中形成的混合溶液分別加入步驟(D)中離心完成后的三組樣品中，并在100℃下反應(yīng)4h后完成過濾；

(G)對經(jīng)步驟(F)后的三組樣品使用截留分子量為11000的透析袋透析，透析開始后的前11h，每隔2h換一次水，11h后每隔7h換一次水，71h后將得到的液體裝入濃縮管中真空濃縮17min備用；

(H)通過重泡漲上樣法將步驟(G)濃縮后的三組樣品分別用pH范圍為4.2的IPG膠條覆蓋，使用液體石蠟密封之后等電聚焦，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7％的二硫蘇糖醇溶液2mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5％的碘乙酰胺溶液3mL，平衡緩沖液平衡17min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％的卡馬斯亮藍，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的乙醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的乙酸對膠條染色，觀察三組樣品的電泳圖像，如果A組電泳結(jié)果可以檢測到明顯的蛋白質(zhì)條帶而B，C組沒有檢測到，則說明土樣中不含有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)來源于古代牛毛微痕跡；

(I)將經(jīng)步驟(H)染色三組樣品的電泳條帶割下來分別裝入三個1.5mL離心管中，每管加入350μL水震蕩洗滌，重復(fù)一次后向每管中加入乙腈與碳酸氫銨溶液1:1混合的脫色液55μL，3min之后用去離子水終止反應(yīng)并重復(fù)洗滌一次，吸出多余的液體，然后將裝有膠粒的離心管開蓋置于真空濃縮儀中干燥；

(J)分別向步驟(I)所得的三組樣品離心管中加入胰凝乳蛋白酶1.5μg，完全蓋住膠粒冰浴45min使膠粒充分吸收酶解液溶脹然后置于30℃烘箱中孵育11h；

(K)將步驟(J)中的酶解液吸出，分別放到另外三個新的1.5mL離心管中，得到三組樣品的原液；

(L)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成20μL的混合液，將所述混合液分別加入到經(jīng)步驟(J)處理后的離心管中，振蕩洗滌20min形成三組樣品的第一新液，分別吸取同一組樣品中的第一新液與同一組樣品中的原液合并以獲得三組樣品的第二新液；

(M)向步驟(L)中的第二新液中再次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液20μL，振蕩洗滌10min，并超聲5min以獲得三組樣品的第三新液，分別吸取同一組樣品中的第三新液與同一組樣品中的第二新液合并以形成三組樣品的最終液體；

(N)將步驟(M)獲得的三組樣品的最終液體離心提純，離心管置于真空濃縮儀濃縮抽干，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的三氟乙酸水溶液于-20℃凍存；

(O)將步驟(N)中形成的多肽混合溶液分別注入二氧化硅C18反向?qū)游雒毠苤校⒁?00nL/min的速度進行洗脫；

(P)將經(jīng)步驟(O)洗脫的三組樣品放入LTQ～Orbitrap XL質(zhì)譜儀，使用正離子模式，離子間分辨率為60000，每次掃描取強度最高的5個母離子進行二級質(zhì)譜檢測；

(Q)對生物質(zhì)譜檢測的蛋白質(zhì)氨基酸序列進行分析，如果A組含有牛毛角蛋白的特征肽段則可判定A為古代牛毛微痕跡。