[發(fā)明專利]一種通過去熱原純化降纖酶的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611136474.4
• 申請(qǐng)日: 2016-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN106834258A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉乃山
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島冠龍生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/64
• 分類號(hào): C12N9/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種純化降纖酶精品的方法。

背景技術(shù)

蛇毒中的降纖酶是哺乳動(dòng)物凝血及纖溶系統(tǒng)的蛋白酶。通過專一性的激活或滅活作用, 該蛋白酶作用于血液凝固、纖溶系統(tǒng)的各個(gè)步驟, 產(chǎn)生促凝或抗凝效應(yīng)。在體外引起血漿纖維蛋白原的凝聚, 起凝血作用; 在體內(nèi)它不激活凝血因子XIII。所有它有分解血漿纖維蛋白原、溶解血栓、降低血液粘度和血小板聚集力的作用。在臨床上蛇毒類凝血酶能用于防治血栓栓塞性疾病、急性腦梗死，以及腦梗死再?gòu)?fù)發(fā)的預(yù)防等。

熱原系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。這里所指的“熱原”，主要是指細(xì)菌性熱原，是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及內(nèi)毒素。致熱能力最強(qiáng)的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽(yáng)性桿菌類，革蘭陽(yáng)性球菌則較弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。當(dāng)含有熱原的物質(zhì)進(jìn)入人體以后，人體會(huì)產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時(shí)體溫可升至40℃以上，嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫，如不及時(shí)搶救，可危及生命。因此去熱原是很多藥用生化產(chǎn)品生產(chǎn)工序中不可缺少的一步。細(xì)菌內(nèi)毒素法是常用的控制熱原的檢測(cè)方法之一。

天然蛇毒中提取的類凝血酶絕大多數(shù)為酸性蛋白質(zhì)，經(jīng)對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，從蛇毒種制備降纖酶多采用陰離子交換柱進(jìn)行分離，并結(jié)合凝膠過濾、親和層析和反相液相色譜等方法進(jìn)行純化。雖然在一定程度上實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化生產(chǎn)，取得了單一成分產(chǎn)品,但是比活更高、去除熱原的降纖酶單一成品的獲得使降纖酶的應(yīng)用更加安全，同時(shí)更能滿足臨床和科研的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過去熱原純化降纖酶的方法。取得比活更高、去除熱原的單一成分降纖酶產(chǎn)品，使其能夠快速、簡(jiǎn)便、低成本的純化降纖酶。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，其步驟如下：

（1）將降纖酶干粉按1:10-30(Kg:L)的比例加入純化水中攪拌溶解后，加入等體積的乙醇以及總體積的5％ (L:Kg) 的乙酸銨攪拌。

（2）按降纖酶干粉1:20-40(Kg:L)的比例加入0.1-0.4mol/L 磷酸鉀溶液，攪拌30分鐘后，再按降纖酶干粉1:20-40(Kg:L)的比例加入0.05-0.3mol/L的乙酸鈣溶液，攪拌均勻。

（3）用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至9.0-10.0，攪拌2-3小時(shí)；3000rpm離心30分鐘，棄去沉淀物取上清液。

（4）上清液用2mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至7.5-8.5，加入10倍量(V/V)95％乙醇，沉淀析出，靜置過夜。

（5）虹吸上層廢乙醇，收集沉淀，3000rpm離心30分鐘。

（6）沉淀物用無水乙醇脫水，3000rpm離心30分鐘。

（7）將沉淀物置五氧化二磷為干燥劑的真空干燥箱中干燥，即得降纖酶成品。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。

實(shí)施例1

（1）將降纖酶干粉按1:15(Kg:L)的比例加入純化水中攪拌溶解后，加入等體積的乙醇以及總體積的5％ (L:Kg) 的乙酸銨攪拌。

（2）按降纖酶干粉1:15(Kg:L)的比例加入0.2mol/L 磷酸鉀溶液，攪拌30分鐘后，再按降纖酶干粉1：30(Kg:L)的比例加入0.1 mol/L的乙酸鈣溶液，攪拌均勻。

（3）用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至9.2，攪拌2.5小時(shí)；3000rpm離心30分鐘，棄去沉淀物取上清液。

（4）上清液用2mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至7.8，加入10倍量(V/V)95％乙醇，沉淀析出，靜置過夜。

（5）虹吸上層廢乙醇，收集沉淀，3000rpm離心30分鐘。

（6）沉淀物用無水乙醇脫水，3000rpm離心30分鐘。

（7）將沉淀物置五氧化二磷為干燥劑的真空干燥箱中干燥，即得降纖酶成品。

得到的降纖酶成品檢測(cè)純度為98.2%，比活力為4090單位/mg，細(xì)菌內(nèi)毒素小于0.01EU/U。

實(shí)施例2

（1）將降纖酶干粉按1:25(Kg:L)的比例加入純化水中攪拌溶解后，加入等體積的乙醇以及總體積的5％ (L:Kg) 的乙酸銨攪拌。