[發明專利]GFPT1穩定低表達的DU145/VCAP細胞系及其構建方法

在審

• 申請號: 201611133376.5
• 申請日: 2016-12-10
• 公開（公告）號: CN108611373A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 樸海龍;劉靜
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種GFPT1低表達的DU145/VCAP細胞系的構建方法。利用慢病毒體系構建GFPT1穩定低表達的DU145/VCAP細胞系。轉染shGFPT1及慢病毒包裝質粒到HEK293T細胞中，收集病毒上清，感染DU145/VCAP細胞，通過嘌呤霉素篩選轉染后的DU145/VCAP細胞，獲得GFPT1低表達的DU145/VCAP穩定細胞系并且通過免疫熒光觀察慢病毒的感染效率，最終經Western Blot技術檢測細胞株GFPT1的表達量下調70％以上，成功構建GFPT1低表達的細胞系，可作為研究GFPT1在前列腺癌腫瘤中的分子作用機制及所參與代謝調控作用的理想細胞系。

技術領域

本發明是構建一種穩定低表達GFPT1蛋白的DU145/VCAP細胞株及其構建方法，涉及生物醫學領域。

背景技術

GFPT1蛋白是編碼己糖胺合成的第一限速酶，這一基因催化形成6-磷酸葡萄糖胺，控制葡萄糖進入己糖胺合成途徑，與細胞內的N-及O-連接的蛋白質的糖基化修飾相關。研究發現，與正常組織及細胞相比，在前列腺癌細胞及前列腺病人的組織樣品中其蛋白質的O-糖基化水平明顯增加，O-糖基化修飾作為潛在的營養感受器，可以調節轉錄、代謝等眾多細胞進程，并與癌癥等人類重大疾病密切相關。而己糖胺合成的限速酶GFPT1的蛋白表達水平在前列腺癌細胞中也明顯增高，同時GFPT1的突變會導致形成先天的肌無力綜合征。在歐洲及美國前列腺癌是男性中發病率最高的腫瘤，因此研究GFPT1對前列腺癌中新的腫瘤標志物及細胞代謝紊亂的標志蛋白的研究具有重要意義，同時也可用于前列腺癌臨床早期診斷、預后判斷等輔助性治療。

發明內容

本發明的目的是提供一種穩定低表達GFPT1蛋白的DU145/VCAP細胞系及其構建方法，該細胞株可作為細胞模型，用于研究GFPT1對腫瘤尤其是前列腺癌發生發展的調控機制以及對細胞代謝通路的影響等生物學功能。

本發明提供的一種低表達GFPT1蛋白的DU145/VCAP穩定細胞株，是以前列腺癌細胞株DU145/VCAP作為宿主細胞，感染帶GFPT1的shRNA基因的慢病毒，經過嘌呤霉素(Puromycin)抗性篩選、擴增后獲得低表達GFPT1蛋白的穩定細胞株。

本發明提供的一種低表達GFPT1蛋白的DU145/VCAP穩定細胞株的構建方法，包括如下步驟：

包裝細胞的轉染

1)轉染前一天將慢病毒包裝細胞293T接種于60mm細胞培養皿以使第二天細胞密度達到60％～70％。

2)在293T細胞中以1:8:9的比例轉染5μg包裝質粒及病毒質粒分別為pVSVg:PSPAX2:shRNA(包含shControl及shGFPT1片段)。

3)轉染8-12h后吸去培養基并加入3ml完全培養基。

4)轉染后72h，將上清放入15ml離心管中，3000轉離心10分鐘，吸取上清并用0.45μm的濾膜過濾，得到所需病毒(后續實驗凡是接觸過病毒液的吸管都要用84消毒液清洗)。

靶細胞感染與篩選

1)感染前24h將靶細胞DU145/VCAP接種于35mm dish或六孔板中以使第二天細胞密度達到50％左右。

2)取1ml病毒液加入5μg/ml polybrene后加入到預感染的DU145/VCAP細胞中，并于37℃、5％CO2培養箱內培養。

3)感染的DU145/VCAP細胞培養8h～24h后吸去培養基，換用完全培養基轉至10cmdish中，繼續培養。

4)24h后用含1.5μg/ml puromycin的培養基換液，等細胞長成后驗證目標基因的表達。