[發明專利]GFPT1穩定低表達的DU145/VCAP細胞系及其構建方法

在審

• 申請號: 201611133376.5
• 申請日: 2016-12-10
• 公開（公告）號: CN108611373A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 樸海龍;劉靜
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種低表達GFPT1蛋白的DU145/VCAP穩定細胞株的構建方法，其特征在于：以前列腺癌DU145/VCAP細胞作為宿主細胞通過慢病毒感染導致細胞中GFPT1蛋白的表達量下調,包括以下步驟：

1)轉染前16-24小時將1.5×10⁶-2×10⁶的293T細胞接種于細胞培養皿用于慢病毒包裝；

2)在293T細胞中轉染3-5μg包裝質粒及病毒質粒，質粒分別為質量比1:8:9-1:9:10的包裝質粒中的pVSVg:包裝質粒中的PSPAX2:病毒質粒中shRNA(shRNA中包含shControl及shGFPT1片段)；

3)轉染8-12h后更換培養基；

4)轉染后72-96h，將上清放入離心管中，3000-5000轉離心10-15分鐘，吸取上清并用0.45μm的濾膜過濾，得到所需病毒；

5)感染前將7×10⁵-1×10⁶個靶細胞DU145/VCAP接種于培養皿培養24-36h，取1ml病毒液加入polybrene使其終濃度為5-10μg/ml后,加入到預感染的DU145/VCAP細胞中；

6)感染的DU145/VCAP細胞培養8h～24h后更換培養基，繼續培養36h～48h；

7)用含終濃度為1.5-2μg/ml puromycin(嘌呤霉素)的培養基更換感染的DU145/VCAP細胞培養的培養基,對細胞進行篩選，存活的細胞即為低表達GFPT1蛋白的DU145/VCAP穩定細胞株。

2.如權利要求1所述構建方法，通過免疫熒光及免疫共沉淀技術(Western)檢測GFPT1的感染效率及表達量的變化。

3.一種采用權利要求1或2所述構建方法獲得的低表達人GFPT1蛋白的DU145/VCAP細胞株。