[發(fā)明專利]DNA片斷與載體快速連接轉(zhuǎn)化的新方法及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2016-12-10
• 公開（公告）號: CN108220314B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉秀梅;樸海龍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/64
• 分類號: C12N15/64;C12N15/70;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發(fā)明涉及一種基因克隆技術(shù)，即對傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)進行了改良，具體地說是運用PCR擴增技術(shù)替代常規(guī)的連接酶反應(yīng)步驟，將待克隆的DNA片斷與載體快速連接并直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗方法。與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)不受限制性內(nèi)切酶酶切位點限制，根據(jù)DNA片段和載體末端序列設(shè)計接頭引物，利用PCR反應(yīng)可將任何DNA片段與載體連接起來，實現(xiàn)分子克隆的目的。該方法作為一種通用方法,不僅縮短了分子克隆反應(yīng)時間，提高了克隆轉(zhuǎn)化效率，而且適用于不同長度基因與載體的連接及轉(zhuǎn)化，具有廣泛的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體地說涉及一種基因克隆改良技術(shù)，即采用PCR擴增方法替代傳統(tǒng)的DNA連接酶反應(yīng)步驟，將待克隆的DNA片段和線性載體作為PCR反應(yīng)模板，利用待克隆的DNA片斷和線性載體兩端接頭引物，通過PCR擴增反應(yīng)，將DNA片斷與線性載體連接起來，并將PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞的分子克隆新方法及其應(yīng)用。與傳統(tǒng)方法相比，用于克隆的DNA片段和載體兩端不受限制性內(nèi)切酶位點限制，不受平滑末端或粘性末端影響，通過設(shè)計簡單的接頭引物，可將任何DNA片段與載體拼接起來，具有操作簡單，實用性強、應(yīng)用廣泛的特點。

背景技術(shù)

基因克隆技術(shù)在生物學中發(fā)揮著重要作用，廣泛應(yīng)用于分子生物學、細胞生物學以及腫瘤生物學等領(lǐng)域，具有巨大的市場需求。傳統(tǒng)的分子克隆實驗包括：DNA片段制備、載體線性化處理、DNA片段與載體連接以及大腸桿菌感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化等。為了將DNA片段與載體連接在一起，提高連接反應(yīng)效率，通常需要預(yù)先分析載體和DNA片段序列，尋找單一特異的限制性內(nèi)切酶酶切位點，將DNA片段和載體末端連接起來，以便后續(xù)連接、轉(zhuǎn)化和篩選陽性克隆。然而，當DNA片斷與載體序列上限制性酶切位點重合較多的情況下，選擇特異性限制性酶切位點變得非常困難，嚴重的影響了連接轉(zhuǎn)化效率。雖然利用DNA連接酶也可以將平滑末端DNA片段與線性載體連接起來，但是通常連接反應(yīng)時間較長，并且連接反應(yīng)效率很低。因此，發(fā)明一種通用的分子克隆方法，使得DNA片段和線性載體不受限制性內(nèi)切酶酶切位點影響，不受平滑末端或粘性末端影響，并且可以在短時間內(nèi)高效率完成克隆反應(yīng)，無疑具有重要的應(yīng)用價值。

為了提高基因克隆效率，滿足不同長度基因克隆需求，各大生物公司不斷推出種類繁多的載體，如質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體、染色體載體等。載體上不僅含有多克隆位點,還含有氨芐霉素或卡那霉素抗性篩選基因，方便基因編輯操作。一些質(zhì)粒載體(如pBR322、pUC18/19)含有可表達β-半乳糖苷酶活性的LacZ基因，PCR產(chǎn)物克隆后可利用α-互補性直接進行藍白菌落篩選。目前應(yīng)用較為廣泛的載體是T-vector，由于線性載體3'末端帶有“T”核苷酸，而PCR產(chǎn)物末端通常帶有“A”核苷酸末端，因此DNA連接酶可以將PCR產(chǎn)物直接克隆到T載體上。然而利用“TA”克隆獲得的產(chǎn)物，無法有效控制DNA片段連接方向，經(jīng)常不能有效表達目的蛋白，而且容易出現(xiàn)假陽性，后續(xù)篩選工作量較大。因此很多載體帶有多克隆位點，使用單一限制酶處理后，可以產(chǎn)生黏性末端，然后將帶有相同酶切位點的PCR產(chǎn)物和線性載體連接，可以有效的提高轉(zhuǎn)化效率。然而在連接酶的作用下，線性載體容易發(fā)生自身環(huán)化而造成假陽性，因此很多載體會使用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進行線性化處理，從而產(chǎn)生不同的粘性末端，防止載體末端自連而降低克隆轉(zhuǎn)化效率。這就要求目的基因兩端帶有與載體末端相同的酶切位點，對限制性內(nèi)切酶位點的選擇變得非常重要，需要了解目的基因和載體的全部序列信息，但是無法對未知基因進行克隆，通常需要在PCR引物上引入特異的酶切位點，以便后續(xù)進行克隆反應(yīng)，因此操作步驟非常繁瑣。

隨著基因克隆技術(shù)的快速發(fā)展，各種快速反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、連接酶層出不窮。近些年，一些生物公司推出了“In fusion”技術(shù)，采用DNA重組酶代替原來的限制性內(nèi)切酶和連接酶反應(yīng)，通過在目的基因和載體兩端設(shè)計同源引物序列，將目的基因與載體末端進行“置換”，從而達到基因克隆的目的。該方法雖然簡化了實驗操作，但是重組酶反應(yīng)在引物設(shè)計方面較為復(fù)雜，同樣存在難于控制基因片段插入的方向性問題，需要克隆載體上含有多種抗性篩選基因，以方便后續(xù)篩選陽性克隆。

發(fā)明內(nèi)容