[發明專利]DNA片斷與載體快速連接轉化的新方法及其應用

有效

• 申請號: 201611133372.7
• 申請日: 2016-12-10
• 公開（公告）號: CN108220314B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 劉秀梅;樸海龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/64
• 分類號: C12N15/64;C12N15/70;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種用于分子生物學中基因克隆的實驗方法，該方法包括如下內容：（1）設計接頭引物：根據線性載體及待克隆的DNA片斷兩端序列，設計連接線性載體與DNA片斷的接頭引物，包含帶有載體3'末端序列與DNA 5'末端序列的F adaptor引物，以及帶有載體5'末端序列與DNA3'末端序列的R adaptor引物；（2）連接反應：不用DNA連接酶，將線性載體、DNA片斷及接頭引物按照所需比例混合，通過PCR擴增反應，將DNA片段與線性載體連接起來；PCR產物中含有DNA和載體的連接產物；（3）轉化：將上述PCR反應液，直接添加到大腸桿菌感受態細胞中進行熱轉化；（4）篩選：采用PCR方法或藍白菌落方法篩選陽性克隆；

其中（1）中連接線性載體與DNA片斷的接頭引物長度介于20~30個核苷酸，GC含量40%~60%，如果接頭引物序列中GC含量超過60%，調整接頭引物長度至31~40個核苷酸；

其中（2）中PCR反應體系，線性載體添加量1~100ng，DNA片斷添加量1~100ng，接頭引物添加終濃度0.2μM~0.4μM；

其中（3）中用于直接轉化大腸桿菌感受態細胞的PCR反應液為大腸桿菌感受態細胞總體積的5%~20%。

2.權利要求1中所述的方法，其中（3）中用于直接轉化大腸桿菌感受態細胞的PCR反應液為大腸桿菌感受態細胞總體積的10%。

3.權利要求1中所述的方法，其中（4）中篩選陽性克隆的方法，根據所用載體確定；

如果載體帶有LacZ基因表達β-半乳糖苷酶活性，利用藍白菌落篩選陽性克隆；否則，根據載體兩端序列設計引物，采用PCR方法檢測陽性克隆。