[發明專利]SPOP及突變體表達的C4-2穩定細胞系及構建方法

在審

• 申請號: 201611133369.5
• 申請日: 2016-12-10
• 公開（公告）號: CN108220242A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 樸海龍;顏敏
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.SPOP野生型及突變1和突變體2表達的C4-2穩定細胞系，此C4-2細胞系構建中所用的質粒使用Ploc.rfp載體克隆，所述Ploc.rfp載體中分別克隆了SPOP野生型、突變體1質粒或突變體2基因；突變體1為SPOP野生型中第87位氨基酸Y轉變N的突變質粒(Y87N)，突變體2為SPOP野生型中第133位氨基酸F轉變L的突變質粒(F133L)。

2.一種權利要求1所述細胞系的構建方法，包括以下步驟：

(1)首先，分別將SPOP野生型以及其突變體1和突變體2質粒克隆到Ploc.rfp的載體上，并分別加入3×Flag的融合標簽；

(2)采用慢病毒包裝體系，使用病毒包裝質粒pVSVG和psPAX2、分別與SPOP野生型質粒、突變體1質粒及突變體2質粒分別共轉染HEK293T細胞，質粒轉染48-72h后分別收集HEK293T含有慢病毒的細胞培養液，用0.22μm的濾膜過濾除去細胞后，將濾液加入預先在細胞板中鋪好的C4-2細胞中，同時加入終濃度4-5μg/mL的polybrene；12-24小時后C4-2細胞更換RPMI 1640培養基；

(3)C4-2細胞病毒感染48-72小時后，在感染后的細胞中加入終濃度8-12μg/mLblasticidin篩選，每36-72小時更換一次含終濃度8-12μg/mL blasticidin的培養基，并繼續篩選；12-16天后得到篩選完成的SPOP野生型及其突變體1和突變體2高表達的C4-2細胞系。

3.根據權利要求2所述的構建方法，具體步驟如下：

(1)采用PCR方法擴增SPOP野生型以及突變體1和突變體2基因，PCR引物為：

SPOP-5’：GAC ATC GAT TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAG ATG TCA AGG GTT CCA AGTCCT CCAC

SPOP-3’：CGGCT AGC TTA GGA TTG CTT CAG GCG TTT G

(2)將步驟(1)所得的PCR產物，通過電泳檢測，并進行下一步的PCR反應；

(3)將產物稀釋100倍，加入SPOP-3’和FLAG-5’引物，將3×FLAG標簽加入到SPOP序列中去；并跑膠，將正確的條帶切割下來，回收；

FLAG-5’：GCGGCCGC ATG GAC TAC AAA GAC CAT GAC GGT GAT TAT AAA GAT CAT GACATC GAT TAC

(4)Ploc.rfp載體和構建好的SPOP片段分別用Not I和Nhe I分別進行雙酶切反應，37℃反應1小時，將酶切后的片段跑膠，回收正確的片段；

(5)T4連接酶反應，分別將切下來的Ploc.rfp載體和SPOP及其突變體1和突變體2片段在室溫連接30分鐘；

(6)將連接酶體系轉入感受態細胞E.coli.DH5a中，熱激，涂ampicillin板，37℃培養12-16小時后，分別得到長有SPOP野生型以及突變體1和突變體2菌斑的板；

(7)挑菌，用加入濃度為50-100μg/mL的ampicillin的LB培養基37℃搖12-16小時，用質粒提取試劑盒提取質粒。

4.根據權利要求2所述的構建方法，HEK293T細胞轉染以及前列腺癌C4-2細胞慢病毒感染，具體步驟如下：

(1)在10cm細胞培養皿中接種1-2×10⁶個HEK293T細胞；

(2)等HEK293T細胞貼壁后進行轉染。使用轉染試劑Thermo transfection reagent。10cm培養皿里分別轉染3μg SPOP野生型質粒及其突變體1質粒和突變體2質粒，同時每個10cm培養皿里轉染2.7μg psPAX2和0.3μg pVSVG質粒；

(3)六孔細胞培養板每個孔接種2-5×10⁵個C4-2細胞；

(4)收集HEK293T細胞含有病毒的培養基，0.22μm濾膜濾除細胞后，加入六孔細胞培養板的C4-2細胞中進行感染，同時加入4-5μg/mL的polybrene；

(5)C4-2細胞更換正常的RPMI 1640培養基進行細胞培養。

5.根據權利要求2所述的構建方法，前列腺癌C4-2細胞的篩選，具體步驟如下：

(1)感染后48-72小時開始用濃度為8-12μg/mL的blasticidin進行穩定細胞系的篩選，每36-72小時更換一次含濃度為8-12μg/mL的blasticidin培養基，持續12-16天；

將上述得到的細胞系用熒光顯微鏡進行綠色熒光蛋白的觀察，以及通過Western blot實驗進行SPOP野生型及其突變體1和突變體2高表達蛋白量的測定。