[發明專利]從矛頭蝮蛇蛇毒提取的血凝酶及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201611131105.6
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN108611341A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 崔亮亮;石皎;李秀琳;李秀娜;丁忠福;葛琳;孫東;薛百忠;王宏英;薛雁
• 申請（專利權）人: 遼寧遠大諾康生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;A61K38/48;A61P7/04
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

本發明提供了一種從矛頭蝮蛇蛇毒(Bothrops atrox)中提取的血凝酶，本發明還提供了所述血凝酶的制備方法，所述方法包括以下步驟：將矛頭蝮蛇蛇毒預處理后，依次經過二乙氨基乙基交聯葡聚糖凝膠A?25離子交換層析；苯甲脒瓊脂糖凝膠4FF(HS)親和層析；以及交聯葡聚糖凝膠G?75凝膠過濾層析；得到矛頭蝮蛇蛇毒血凝酶。本發明還提供了一種矛頭蝮蛇蛇毒血凝酶在制備用于治療出血病癥的藥物中的應用。與現有技術相比，本發明的制備工藝步驟少，周期短，減少過程環境暴露風險；產品收率高，工藝去除雜質能力強，能夠獲得收率35％以上、純度98％以上的矛頭蝮蛇血凝酶；工藝穩定性高，產品質量一致性好，利于臨床用藥安全。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種從矛頭蝮蛇蛇毒提取血凝酶，本發明還涉及從矛頭蝮蛇蛇毒提取血凝酶的方法及該血凝酶的用途。

背景技術

凝血是復雜的生理過程，大體分為三個階段：第一階段，凝血因子X(coagulationfactor X，FX)激活；第二階段，凝血酶原激活；第三階段，纖維蛋白原變為纖維蛋白。

從蛇毒中提取止血藥具有悠久的歷史。目前，臨床應用較為成功的有瑞士生產的止血藥Reptilase，即立止血，它的主要成分是從巴西蛇(Bothrops Jrarace,Lachesisatrox)的毒液中提取的蛇毒類凝血酶(Snake Venom Thrombin-like Enzyme，SVTLE)，該酶屬于胰蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶，具有精氨酸酯酶和酰胺酶活性。該酶在體外可將纖維蛋白原水解為纖維蛋白，而不需要其他凝血因子的參與，在體內不激活凝血因子ⅩⅢ，形成的纖維蛋白凝塊不穩定，易于被纖溶系統溶解，從而不影響血小板的激活和釋放，不具有血栓形成危險。由于類凝血酶在結構和功能上與人凝血酶相似，故稱為“類凝血酶”。迄今為止，已經在30多種蛇毒中發現類凝血酶，并成功分離純化了20余種，其中10余種類凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到闡明(鄭穎，沈居仁，張富強等，尖吻蝮蛇血凝酶N末端序列測定及其止血活性分析[J].中國醫科大學學報)。

由于天然蛇毒中提取的類凝血酶絕大多數為酸性蛋白質，因此多采用陰離子交換柱進行分離，并結合凝膠過濾、親和層析和反相液相色譜等方法純化。

在已報道的文獻中，蛇毒類凝血酶的提取純化方法包括：

1)將蛇毒預處理后，進行二乙氨基乙基-葡聚糖凝膠A50(DEAE-Sephadex A50)陰離子交換層析和分子篩Sephadex G 100層析分離。該工藝預處理過程煩瑣，造成酶活性成份損失較多，影響產品的比活力和收率，且在預處理中用到苯酚及其衍生物、甲醇等有機溶劑，影響后期的純化，不適于規?；a。

2)將蛇毒預處理后，進行肝素-溴化氰-瓊脂糖凝膠4B(Heparin-CNBr-Sepharose4B)親和層析分離。該工藝預處理方法雖較前法略簡單，但在預處理中同樣用到苯酚的衍生物，且工藝活性收率較低，僅為7.4％，不適于規?；a。

申請號為200610044594.1的中國專利申請公開了一種從矛頭蝮蛇蛇毒中提取單一成分巴曲酶的方法。其公開了矛頭蝮蛇蛇毒經溶解、過夜、離心、Benzamidine Sepharose6B親和層析、Sephadex G-25層析、透析、(SP Sepharose、S Sepharose或CM Sepharose)陽離子柱層析和(Sephacry1S200、Sephacry1S100或Superdex-75)分子篩層析純化得到單一組分巴曲酶。但是該專利層析步驟繁瑣、其中陽離子柱采用階段梯度洗脫或直線梯度洗脫，不利于大規模生產中熱源與雜質去除。