[發(fā)明專利]從矛頭蝮蛇蛇毒提取的血凝酶及其制備方法和用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611131105.6
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN108611341A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔亮亮;石皎;李秀琳;李秀娜;丁忠福;葛琳;孫東;薛百忠;王宏英;薛雁
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧遠(yuǎn)大諾康生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;A61K38/48;A61P7/04
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

1.一種血凝酶，所述血凝酶來源于矛頭蝮蛇蛇毒，具有以下特征：

1)血凝酶分子量為31731Da，去糖后分子量為25575Da，N-糖含量為19.4％，3個N-糖基化位點(diǎn)分別為N₉₈、N₁₄₆與N₂₂₅；

2)等電點(diǎn)為5-6；

3)血凝酶N端序列為：VIGGDECDINEHPFL；

4)血凝酶包含6對二硫鍵，無自由巰基；

5)血凝酶蛋白序列含232個氨基酸；

優(yōu)選地，所述血凝酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：

VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPQYFCGMTLINQEWVLTAAHCDKTYMRIYLGIHTRSVANDDEVIRYPKEKFICPNKKKNVITDKDIMLIRLNRPVKNSTHIAPISLPSNPPSVGSVCRIMGWGAITTSEDTYPDVPHCANINLFNNTVCREAYNGLPAKTLCAGVLQGGIDTCGGDSGGPLICNGQFQGILSWGSDPCAEPRKPAFYTKVFDYLPWIQSIIAGNKTATCPP。

2.一種從矛頭蝮蛇蛇毒提取血凝酶的方法，所述方法包括以下步驟：

將矛頭蝮蛇蛇毒預(yù)處理后，依次經(jīng)過二乙氨基乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠(DEAE SephadexA-25)離子交換層析；苯甲脒瓊脂糖凝膠4FF(HS)(Benzamidine Sepharose 4FF(HS))親和層析；以及交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex G-75)凝膠過濾層析，得到矛頭蝮蛇蛇毒血凝酶原液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

1)將矛頭蝮蛇蛇毒溶于pH 7.0-7.5、0.01M-0.05M的Tris-HCl緩沖液，得到濃度為50-200mg/ml，優(yōu)選地為80-150mg/ml，更優(yōu)選地為100mg/ml的溶液，然后離心取上清液；

優(yōu)選地，所述Tris-HCl緩沖液的pH值為7.4，濃度為0.02M；

優(yōu)選地，所述離心的條件為：4℃下，3000rpm-5000rpm，離心時間為5-20min，優(yōu)選地為10min；

2)將步驟1)得到的上清液進(jìn)行DEAE Sephadex A-25離子交換層析，使用含有0.2M-0.4M NaCl的、pH為7.0-7.5、濃度為0.01M-0.05M的Tris-HCl緩沖液直線洗脫，根據(jù)280nm波長下的吸收峰收集，得到包含凝血活性組分的洗脫液；

優(yōu)選地，所述Tris-HCl緩沖液的pH為7.4，濃度為0.02M；

優(yōu)選地，所述Tris-HCl緩沖液所含NaCl的濃度為0.3M；

3)將步驟2)得到的包含凝血活性組分的洗脫液用含有0.5M-1.5M NaCl的、pH為7.0-7.5、濃度為0.01-0.06M的Tris-HCl緩沖液透析，再進(jìn)行Benzamidine Sepharose 4FF(HS)親和層析，使用含有0.05-0.3M精氨酸、0.5M-1.5M NaCl、pH為7.0-7.5、濃度為0.01-0.06M的Tris-HCl緩沖溶液洗脫，收集目標(biāo)組分；

優(yōu)選地，所述Tris-HCl緩沖液的pH為7.0，濃度為0.05M；

優(yōu)選地，所述Tris-HCl緩沖液所含精氨酸的濃度為0.1M；

優(yōu)選地，所述Tris-HCl緩沖液所含NaCl的濃度為1.0M；

4)將步驟3)收集的目標(biāo)組分經(jīng)Sephadex G-75凝膠過濾層析，使用pH7.0-7.5，濃度為0.05M-0.3M的磷酸鹽緩沖液洗脫后，收集洗脫液，得到矛頭蝮蛇蛇毒血凝酶原液；

優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.4，濃度為0.1M。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，在進(jìn)行DEAE Sephadex A-25離子交換層析之前，使用pH 7.0-7.5、濃度為0.01M-0.05M的Tris-HCl緩沖液平衡3個柱體積；

優(yōu)選地，柱流速為0.8-3ml/min，更優(yōu)選地為2ml/min；

優(yōu)選地，所述Tris-HCl緩沖液的pH為7.4，濃度為0.02M。