[發明專利]一種高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法

有效

• 申請號: 201611128631.7
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN106706582B
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 張芳琳;馬宏煒;雷迎峰;張亮;程林峰;陳何嵩;石靜琦;韓佩君;葉偉;吳興安;徐志凱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/569
• 代理公司: 西安智大知識產權代理事務所 61215
• 代理人: 劉國智

本發明公開了一種高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法。本發明的特征在于利用In?cell Western(ICW)法簡便、直觀地檢測被HTNV感染的細胞。該方法檢測靈敏度高(可檢測5g的目的蛋白)、周期短(72小時)、結果判讀客觀、可重復性好、高通量、方法可標準化，便于實驗室間推廣，特別可針對無細胞病變效應病毒檢測其感染力。本發明同時公布了上述方法在HTNV感染力測定(TCID₅₀)、HTNV中和抗體效價測定、抗HTNV分子篩選和鑒定、人HTNV疫苗免疫保護性評價等方面的應用。

技術領域

本發明屬于漢灘病毒檢測技術領域，涉及一種高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法。

背景技術

漢灘病毒(Hantaan virus,HTNV)隸屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(Hantavirus)，是單股負鏈RNA病毒，基因組由L、M、S三個片段組成，分別編碼病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)、包膜糖蛋白(GP)和核衣殼蛋白(NP)。該病毒的宿主動物和傳染源均為嚙齒動物，主要通過動物排泄物污染而經由呼吸道、消化道或破損的皮膚等途徑傳播給人類，引起一類自然疫源性疾病，即腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renalsyndrome，HFRS)。該病臨床表現為發熱、出血和急性腎功能損害，具有流行范圍廣、發病人數多、病死率高等特點。

我國是世界上HFRS疫情最嚴重的國家，每年發病人數占世界總發病數90％以上，死亡率為0.1-15％。據文獻報道，1950-2007年間，我國共發生1,557,622例HFRS，其中死亡46,427例，死亡率約為3％；另據中國疾病預防控制中心統計，2015年我國全年共發生10,812例HFRS，死亡63例。由于HTNV的宿主廣泛，傳播途徑多，且目前為止臨床上尚缺乏特異有效的治療藥物，因此其防治任務十分艱巨。值得注意的是，HTNV還是國際《禁止生物武器公約》所列入的生物戰劑，對未來軍事活動構成潛在的威脅。

開發、研制HTNV預防性疫苗被認為是預防HTNV感染所致HFRS的最根本手段，而預防性疫苗成功與否的關鍵是其能否誘導有效的體液免疫。高滴度HTNV中和抗體可有效抵抗外來HTNV的感染，因此建立穩定、有效的疫苗評價系統，檢測疫苗免疫反應的保護效果，對于疫苗的研制和質控具有重要意義。

中和試驗(neutralization test)是指病毒與相應的抗體結合,抗體中和病毒使其失去了對敏感細胞的感染力，該實驗可從待檢血清中檢出抗體,或從病檢樣本中檢出病毒,從而診斷病毒性傳染病，也可測定抗病毒血清中和效價，或者對新分離病毒進行鑒定和分型。其原理是特異性的抗病毒免疫血清(中和抗體)與病毒作用,能夠抑制病毒對敏感細胞的吸附、穿入和脫殼,從而阻止了病毒的繁殖,失去了感染能力。值得注意的是，該反應不僅表現為質的方面,即一種病毒只能被相應的免疫血清中和；而且也表現在量的方面,即中和一定量病毒的感染力,需要一定效價的抗體。

通過中和試驗檢測病毒中和抗體效價是評價疫苗保護效果的常用方法。常用的中和試驗包括簡單定性法、固定樣本稀釋病毒法、固定病毒稀釋樣本法及空斑減少法。空斑減少法是“金標準”，即用系列稀釋的患者血清與等量的已知滴度病毒懸液(100TCID₅₀)混合，在室溫下作用一段時間后接種敏感細胞進行培養，以能保護半數細胞培養孔不產生細胞病變(CPE)的血清最高稀釋度作為終點效價。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法，通過In-cell Western(ICW)技術檢測HTNV感染細胞內的病毒核衣殼蛋白，并基于此測定HTNV滴度，具有測靈敏度高、周期短的優勢。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法，包括以下操作：

1)將A549細胞均勻接種于ICW用微孔板中，培養至80～90％的細胞匯合度；