[發明專利]一種高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法

有效

• 申請號: 201611128631.7
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN106706582B
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 張芳琳;馬宏煒;雷迎峰;張亮;程林峰;陳何嵩;石靜琦;韓佩君;葉偉;吳興安;徐志凱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/569
• 代理公司: 西安智大知識產權代理事務所 61215
• 代理人: 劉國智

1.一種高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法，其特征在于，包括以下操作：

1)將A549細胞均勻接種于ICW用微孔板中，接種細胞數為(2-4)×10⁴/孔，接種孔數＝待測樣本數×稀釋次數×復孔數，培養至80～90％的細胞匯合度；

2)待步驟1)中細胞匯合度達到70～80％時，采用固定病毒稀釋樣本的方法進行混合液的制備：將待測樣本等比梯度稀釋，每個稀釋比例的待測樣本分別與等體積的HTNV混合，于37℃孵箱中孵育2h，期間輕柔地顛倒混勻數次；

3)吸棄步驟1)微孔板中的培養液，每孔加入DPBS洗滌1-2次，然后將步驟(2)中孵育完成的混合液加入微孔板，每個稀釋梯度設多個重復樣，加樣順序按照從低到高進行；同時設置病毒陰性對照組、同型對照組、病毒陽性對照組、空白對照組；

4)將步驟(3)中的微孔板放入37℃孵箱孵育2.5h后吸棄混合液，每孔加入洗滌DPBS1-2次，再向每孔加入含有2％FBS的DMEM；

5)將步驟4)中微孔板放入37℃孵箱孵育2d后取出進行ICW檢測；

6)ICW檢測HTNV感染細胞內的NP：首先吸棄微孔板中的培養液，加入PBS洗滌；然后向每孔中加入4℃預冷的固定緩沖液進行固定，免搖動在室溫條件下孵育；吸棄固定緩沖液，用透膜緩沖液洗脫細胞；吸棄透膜緩沖液，沿管壁向每孔加入封阻液，在搖床上緩慢上搖動室溫下孵育；吸棄封阻液，沿管壁向每孔加入一抗，室溫下緩慢搖動孵育；吸棄一抗，加入洗滌緩沖液，洗滌多次；吸棄洗滌緩沖液，沿管壁向每孔加入二抗，室溫下避光緩慢搖動，孵育；加入洗滌緩沖液，室溫下避光緩慢搖動，洗滌多次；洗脫結束之后，完全去除洗脫液；最后，洗脫后的微孔板采用近紅外雙色熒光成像系統進行掃描，使用700nm和800nm兩個通道同時掃描，以獲取HTNV NP的紅外熒光強度；

7)計算HTNV中和抗體效價：

獲得每孔在700nm和800nm通道的紅外熒光強度，然后計算每孔中HTNV NP紅外熒光強度相對比NIR，NIR＝NP熒光值/內參蛋白熒光值；再利用Karber方法計算獲得待測樣本中和滴度，即中和抗體效價。

2.如權利要求1所述的高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法，其特征在于，所述用Karber方法計算待測樣本中和滴度具體為：

1)計算各病毒稀釋度陽性孔數目P和陰性孔數目N，陽性孔的判別標準為，若該孔HTNV感染系數≥1.5，則該孔為陽性，否則為陰性；

其中，NIR本底值為本底組四個孔NIR的算術平均值，微孔板的陽性對照組HTNV感染系數≥1.5是采用該組檢測結果，否則重復此板結果；

2)計算中和比值之和，每個稀釋梯度的中和比值＝陰性孔/復孔總數，

中和比值之和＝所有稀釋梯度的感染比值之和；

3)計算稀釋組距，將梯度稀釋比例換算成10的指數，以指數等差排列的公差作為稀釋組距；

4)計算中和滴度，用Karber法分別測定LgPD50及中和效價，LgPD50＝L+D×(S－0.5)；中和效價＝PD50；其中，L為最低稀釋度的對數；D為稀釋組距；S為中和比值之和。

3.如權利要求1所述的高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法，其特征在于，所述的一抗包括抗HTNV NP鼠單抗，以及抗β-actin兔多抗；所述的二抗包括Goat anti-rabbit IRDye^TM 680和Goat anti-mouse IRDye^TM 800CW，分別用以檢測700nm和800nm通道的熒光強度。

4.如權利要求1所述的高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法，其特征在于，在A549細胞感染HTNV后第二天進行ICW檢測。

5.如權利要求1所述的高通量快速檢測漢灘病毒中和抗體效價的方法，其特征在于，所述A549細胞感染HTNV的感染劑量為MOI＝0.1。