[發明專利]一種油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法

有效

• 申請號: 201611124385.8
• 申請日: 2016-12-08
• 公開（公告）號: CN106596876B
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 俞愛敏;馬貴軍;石海芳
• 申請（專利權）人: 申聯生物醫藥（上海）股份有限公司
• 主分類號: G01N33/15
• 分類號: G01N33/15;G01N1/34
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

本發明提供了一種油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，包括以下步驟：將油佐劑疫苗破乳，將破乳后的抗原樣品進行定量分析，同時采用凝膠電泳的手段進行純化，然后將純化后的抗原樣品進行定性檢測；所述破乳方法為：將油佐劑疫苗與正丁醇混合，然后加入競爭劑混勻后，離心，取水相溶液超濾、洗濾后，進行真空冷凍干燥或濃縮，即得抗原樣品。本發明通過加入競爭劑與表面活性劑競爭抗原結合位點，從而將油佐劑疫苗中的抗原釋放至水相中，大大提高了水相中的抗原回收率；通過將破乳后的抗原采用電泳進行分離純化，提高了抗原的純度，使抗原中的表面活性劑雜質含量基本為0，從而使純化后的樣品定性檢測時重復性良好，提高了檢測結果的準確性。

技術領域

本發明涉及口蹄疫疫苗檢測技術領域，具體涉及一種油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法。

背景技術

現有的疫苗質量標準中規定效力檢驗必須采用本動物進行檢驗，由于國家實行100％的強化免疫政策，很難選出易感的檢驗用動物，而且動物攻毒對實驗設施要求高(BSL3級實驗室)、耗時長(一個月以上)、資金花費大。如果采用血清中和試驗選擇易感動物，在技術上難以排除具有細胞免疫的非易感動物，在檢驗實際中經常發生檢驗數據不規律的問題，影響檢驗的準確性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的質量檢測一直困擾著獸藥監測部門和相關生產企業。因此需要盡快研制體外檢驗技術，代替現有的本動物試驗。

當前國家對疫苗的檢驗正逐步過渡到對疫苗內抗原的檢測，而當前較為普遍的方法為疫苗破乳后對抗原進行檢測，通過將疫苗進行破乳處理，使抗原轉移至水相中，繼而對其進行后續的檢測分析。眾所周知，疫苗是由抗原與佐劑以一定比例、按特定程序乳化而成的，然而佐劑卻為疫苗破乳檢測帶來了巨大障礙。

現有技術中主流的樣品純化手段為各類層析，而層析過程所需要的樣品量大，不僅會造成約30％～50％的樣品損失(在起始樣品量低時更易引起擴散作用)，同時對設備依賴性較高。油佐劑疫苗中的抗原濃度為微克級，經過破乳過程后會造成一部分抗原的損失，再使用層析的方式進行純化，其抗原回收率極低，無法用于檢測，若加大疫苗破乳量，則會造成疫苗浪費，且油佐劑中雜質會加速縮短層析填料使用壽命，其經濟性不佳。

現有的凝膠電泳純化技術中，所分離的復雜樣品其成分均為生物分子及其同類物，而非其他復雜性質的物質，其中處理的樣品成分相比于破乳后水相其樣品狀態更為簡單。現有的蛋白質電泳后膠內酶解技術，其程序較多，步驟復雜，經過操作后其回收率低，微量樣品經過處理后所能回收的樣品已無法滿足檢測要求。

目前國內各大廠家都在探索一種實用的方法，能夠對經破乳處理的疫苗中抗原進行處理，減少抗原中的雜質對其后續定性定量檢測分析的影響。破乳后水相中存在的表面活性劑等物質在業內被公認為最難處理的雜質，業內現有技術并不能對破乳后水相直接進行檢測。本發明中針對的樣品成分復雜，且疫苗中蛋白濃度低并不適合傳統純化方法，破乳后水相中又含有的表面活性劑等雜質，不僅以游離狀態存在，其雙親的性質還會與蛋白相結合，在電場力的作用下會使得雜質與蛋白的結合鍵打開，在凝膠中實現分離純化。通過凝膠電泳的方式純化相比傳統方式其所需的樣品量將大大減少，并大幅降低對操作人員及儀器設備的依賴性，同時可使與蛋白黏連的雜質與蛋白分離。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明提供了一種油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

本發明提供了一種油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，包括以下步驟：將油佐劑疫苗破乳，將破乳后的抗原樣品進行定量分析，同時采用凝膠電泳的手段進行純化，然后將純化后的抗原樣品進行定性檢測；

所述破乳方法為：將油佐劑疫苗與正丁醇混合，然后加入競爭劑混勻后，離心，取水相溶液超濾、洗濾后，進行真空冷凍干燥或濃縮，即得抗原樣品。

優選地，所述競爭劑為氨基酸及其衍生物中的至少一種。