[發明專利]一種油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法

有效

• 申請號: 201611124385.8
• 申請日: 2016-12-08
• 公開（公告）號: CN106596876B
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 俞愛敏;馬貴軍;石海芳
• 申請（專利權）人: 申聯生物醫藥（上海）股份有限公司
• 主分類號: G01N33/15
• 分類號: G01N33/15;G01N1/34
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

1.一種油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：將油佐劑疫苗破乳，將破乳后的抗原樣品進行定量分析，同時采用凝膠電泳的手段進行純化，然后將純化后的抗原樣品進行定性檢測；

所述破乳方法為：將油佐劑疫苗與正丁醇混合，然后加入競爭劑混勻后，離心，取水相溶液超濾、洗濾后，進行真空冷凍干燥或濃縮，即得抗原樣品。

2.根據權利要求1所述的油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，所述競爭劑為氨基酸及其衍生物中的至少一種。

3.根據權利要求2所述的油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，所述競爭劑為賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和脯氨酸中的一種。

4.根據權利要求1所述的油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，所述競爭劑的加入量為：每1ml油佐劑疫苗中加入1-40mg競爭劑。

5.根據權利要求1所述的油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，所述采用凝膠電泳的手段進行純化的具體步驟為：

S1、將抗原樣品進行凝膠電泳，然后進行染色確定目標蛋白條帶；

S2、將含目標蛋白的凝膠切成1～2mm³大小的膠塊進行脫色處理，然后進行樣品處理；

S3、經處理后的膠塊再進行超聲萃取，所得上清液進行真空冷凍干燥或濃縮，即可。

6.根據權利要求1所述的油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，所述采用凝膠電泳的手段進行純化的具體步驟為：

S1、將抗原樣品進行凝膠電泳，然后取其中一個泳道的凝膠進行染色確定目標蛋白條帶位置；

S2、將未染色凝膠上與染色的凝膠上目標蛋白條帶位置相同的凝膠切成1～2mm³大小的膠塊進行樣品處理；

S3、經處理后的膠塊再進行超聲萃取，所得上清液進行真空冷凍干燥或濃縮，即可。

7.根據權利要求5或6所述的油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，步驟S1中，所述凝膠電泳采用的條件為：采用丙烯酰胺質量含量為5％的濃縮膠和丙烯酰胺質量含量為12％分離膠，210V電壓下處理30-40min。

8.根據權利要求5或6所述的油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，步驟S2中，所述樣品處理具體包括以下步驟：

A1、將含目標蛋白的膠塊經ddH₂O清洗、乙腈震蕩脫水后，加入含二硫蘇糖醇的NH₄HCO₃水溶液進行第一次孵育；

A2、經第一次孵育后的膠塊用乙腈震蕩脫水后，再加入含碘乙酰胺的NH₄HCO₃水溶液進行第二次孵育；

A3、經第二次孵育后的膠塊用乙腈震蕩脫水后，加入含胰蛋白酶的NH₄HCO₃水溶液進行第三次孵育；

所述第一次孵育條件為：56℃下孵育30min；第二次孵育條件為：室溫避光孵育20min；第三次孵育條件為：56℃下孵育3h。

9.根據權利要求1所述的油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，所述定量分析采用HPLC檢測。

10.根據權利要求1所述的油佐劑疫苗的精確定性定量檢測方法，其特征在于，所述定性分析采用LC/MS檢測。