[發明專利]一種甘藍型油菜CMS恢復系的快速批量選育方法

在審

• 申請號: 201611123137.1
• 申請日: 2016-12-08
• 公開（公告）號: CN106613909A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 董育紅;田建華;關周博;韋世豪;鄭磊;李永紅
• 申請（專利權）人: 陜西省雜交油菜研究中心
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H1/04;A01H1/08;A01H4/00
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種快速批量選育CMS恢復系的育種方法，其特征在于，該方法所構建的聚合親本包含有眾多適于不同生態區域的優良性狀基因；借助化學誘導雄性不育技術，進行4個世代的輪回，各優良品種進行了充分的互交，眾多優良性狀基因進行了充分的聚合重組，從而產生了一個新的擁有眾多優良性狀基因的聚合群體；通過小孢子培養獲得的DH分離群體，放在4個不同生態區進行性狀選擇和基因型鑒定，最終選育出一批分別適于各自生態區域的優良CMS恢復系。

2.如權利要求1所述的快速批量選育CMS恢復系的育種方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)以長江上、中、下游和黃淮區國審的18個甘藍型油菜CMS三系雜交品種等量混合做為聚合親本；

2)當年秋播，把聚合親本按1:2行比種植在隔離網室，行比1的做父本，行比2的做母本；

3)在蕾苔期，利用化學雜交劑“SX-1”誘導母本產生雄性不育；

4)在油菜花期，通過人工輔助授粉，使母本充分授粉結實，成熟時僅收取母本種子，做為下一個輪回的親本；

5)重復步驟2)到步驟4)，直至進行4個世代的輪回；

6)把經過4個世代輪回產生的聚合群體秋季播種，第2年花期，選用該群體正常可育植株主花序和上部分枝上長度3.5-4.0mm的花蕾，以0.5mmol/L的秋水仙堿加倍染色體48小時，通過小孢子培養獲得雙單倍體分離群體。

7)把該DH分離群體中正常可育的株系分別種植在4個不同生態區，依據該生態區的育種目標進行表現型選擇，同時和CMS不育系測交進行基因型鑒定，最終選育出一批分別適應長江上、中、下游和黃淮區的優良CMS恢復系。

3.如權利要求2所述的快速批量選育CMS恢復系的育種方法，其特征在于，18個CMS三系雜交種等量混合構成的聚合親本，其基因型為S(R,r)，經過4個世代聚合重組產生新的聚合群體；花期取聚合群體正常植株的花蕾經小孢子培養獲得的DH分離群體，不育株系直接淘汰；正常株系分別種植在4個生態區，依據各生態區育種目標進行表現型選擇符合育種目標的優良株系與CMS不育系進行測交。

4.如權利要求2所述的快速批量選育CMS恢復系的育種方法，其特征在于，利用化學雜交劑“SX-1”誘導母本產生雄性不育，要求如下：

1)在油菜蕾苔期，母本苔高20cm，主花序最大花蕾長2mm左右時，利用化學雜交劑“SX-1”涂抹油菜莖干，誘導母本產生雄性不育；在蕾苔期，對母本行滿足要求的植株逐個進行涂莖處理；

2)涂莖誘導方法：吸取“SX-1”原液用食用油配成濃度為5.5-6.5mg/L的藥液，用毛筆涂抹在油菜莖干上，涂抹位置距離地面10cm左右，涂抹長度5cm左右。

5.如權利要求2所述的快速批量選育CMS恢復系的育種方法，其特征在于，油菜小孢子培養方法：

1)油菜小孢子的分離提取

在油菜初花一周內，取聚合群體正?？捎仓曛骰ㄐ蚝蜕喜糠种ㄐ蛏祥L度為3.5-4.0mm的花蕾用蒸餾水沖洗干凈；在超凈工作臺上先用70％酒精滅菌30s，再用20％次氯酸鈉滅菌15min，然后用無菌水沖洗3次；取滅菌好的花蕾放入B5培養基中研磨成勻漿；用300目雙層尼龍網過濾，10ml離心管收集濾液，經800rpm離心5min，吸去上清液，加入液體B5培養基懸浮小孢子，再離心，重復3次，吸去上清液；

2)染色體加倍

在上述離心管中加入含有0.5mmol/L秋水仙堿的NLN-13培養基，懸浮小孢子，并分裝于150ml三角瓶中，用滅菌的尼龍紙封口，32℃暗培養48h；

3)小孢子培養

將經過上述處理的溶液1000rpm離心5min，吸取上清液，去除秋水仙堿，并加入無激素的NLN-13培養基懸浮洗劑和離心1次，最后加入含6-BA0.05mg/L、NAA0.5mg/L的NLN-13培養基懸浮小孢子，接著將小孢子溶液分裝于直徑為7.5cm的無菌培養皿中，每皿7.5ml，Parafi lm封口，在32℃的水浴恒溫培養箱中暗培養24h，然后轉移至25℃的水浴恒溫培養箱中培養；當肉眼可見胚時，將培養皿轉移至搖床上，在25℃下40-60rpm暗培養7d；7d后改用較大的培養皿和含有ABA0.3mg/L的NLN-13培養基在25℃條件下40-60rpm搖床光照培養；以后用相同的培養條件每7d繼代1次，直到胚發育成熟，并長出完整的子葉，分化成苗后將其轉移至含有6-BA0.5mg/L的B5固體培養基上進行繼代和增殖，適時移栽至大田。