[發明專利]一種水痘?帶狀皰疹病毒糖蛋白E胞外區蛋白的制備方法

在審

• 申請號: 201611119488.5
• 申請日: 2016-12-08
• 公開（公告）號: CN107022559A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 李春明;徐俊峰;雙慧;李海燕;朱曉文;王麗;沈紅杰
• 申請（專利權）人: 長春祈健生物制品有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C07K14/04;A61K39/295;A61K39/25;A61P31/22;C12R1/19
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域：

本發明提供一種水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E胞外區蛋白的制備方法，具體地說涉及含水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E胞外區基因重組質粒載體，用該載體制備的轉化體，及利用轉化體制備水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E胞外區蛋白，涉及該蛋白在單價、多價水痘或帶狀皰疹疫苗，及含有此成分的聯合疫苗的研發、生產、檢驗檢測領域的應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-zoster virus，VZV）是引起水痘和帶狀皰疹的病原體，兒童時初發引起水痘，潛伏后可以再度激活引起帶狀皰疹。目前，控制水痘和帶狀皰疹的主要方法是接種疫苗。

水痘疫苗和帶狀皰疹疫苗現均為減毒活疫苗。減毒活疫苗的制備要求在經國家權威部門檢測合格的細胞基質中進行，并且制備工藝復雜，工藝控制較為困難。另外，根據水痘減毒疫苗近20年的市場應用情況分析，接種水痘疫苗并不能完全保護接種者免受水痘侵襲，會有突破病例發生，以及疫苗株有潛伏的風險，這就是水痘-帶狀皰疹病毒病毒的特殊之處。帶狀皰疹減毒活疫苗應用于成人，對帶狀皰疹的發生有預防作用，根據減毒帶狀皰疹疫苗的臨床應用分析，總體保護率為62%，效果差強人意。 葛蘭素史克公司用CHO細胞表達VZV的gE糖蛋白，輔以AS04佐劑制備的新一代帶狀皰疹疫苗，有效激發接種者的細胞免疫和體液免疫水平。根據其提供的III期臨床結果分析，有效率大于 90%，效果較好。

VZV-gE糖蛋白由ORF68編碼，有623個氨基酸組成，為I型跨膜糖蛋白，由信號肽、胞外區、跨膜區和胞內區構成。gE糖蛋白在病毒和感染細胞表面表達最為豐富，并兼有T、B細胞表位，所以針對VZV-gE的研究最為廣泛，期望其成為新一代的亞單位水痘或帶狀皰疹疫苗。也有研究者只截取gE的37-161氨基酸保守序列研制亞單位疫苗，但因其片段較小、涵蓋表位較少、免疫原性弱而不利于應用。

真核細胞表達系統表達的蛋白表達量低、其蛋白糖基化不一致，導致蛋白有異質性差異，并且有些蛋白的免疫原性與糖基化并無緊密關聯。據此，我們利用大腸桿菌表達系統表達目的蛋白，評價其免疫原性，為將來的疫苗研究打下基礎。利用大腸桿菌表達系統表達目的蛋白，凸顯了大腸桿菌表達系統蛋白表達量高、操作簡便、工藝可控性強，易于實現自動化、無宿主細胞核酸及蛋白殘留等特點。

發明內容：

本發明提供一種水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E胞外區蛋白的制備方法，利用大腸桿菌表達系統表達目的蛋白，凸顯了大腸桿菌表達系統蛋白表達量高、操作簡便、工藝可控性強，易于實現自動化、無宿主細胞核酸及蛋白殘留等特點。

本發明公開的一種重組質粒載體，由已優化為大腸桿菌偏愛密碼子的水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E胞外區基因與表達載體pET-21b連接構建而成，其核酸序列如SEQ NO.1所示，其對應的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

本發明公開的一種轉化體，其特征在于由上述的重組質粒載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)獲得。

本發明所述的一種制備水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E胞外區蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）以優化為大腸桿菌偏愛密碼子的合成質粒為模板，用兩端設計為Nhe I和EcoR I酶切位點的引物進行PCR擴增，純化PCR產物；

正向引物為（5'-3'）：TCCTAGCTAGCATGACCAATCC GGTTCGCG CCAGCGTGC；反向引物為（5'-3'）：TTCCGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGACGCAGCAGC GGGCTTGTACCCGGAT；

2）將步驟1）獲得的PCR產物和pET-21b載體用內切酶Nhe I和EcoR I雙酶切，再將酶切產物連接，構建重組質粒載體；將重組質粒載體轉化大腸桿菌感受態細胞，經篩選得到陽性克隆。

3）將陽性克隆質粒轉入BL21（DE3）表達菌中，挑選克隆，誘導表達，獲得陽性表達菌。

4）陽性表達菌大量擴增，在37℃用0.1-10mMIPTG誘導4-6h，可獲得VZV-gE胞外區蛋白。

本發明所述的一種水痘疫苗或者帶狀皰疹疫苗，是由按照本發明制備水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E胞外區蛋白方法制備的VZV-gE胞外區蛋白抗原成分和疫苗佐劑配制而成。

本發明所述的一種聯合疫苗或者多價疫苗，含有按照本發明制備水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E胞外區蛋白方法制備的VZV-gE胞外區蛋白抗原成分與疫苗佐劑配制而成。