[發(fā)明專利]一種ZNF667蛋白的RNA干擾質(zhì)粒及其應(yīng)用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611114524.9
• 申請日: 2016-12-07
• 公開（公告）號: CN106636200B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 譚思創(chuàng);譚斯品;成柯;陳志康;段元冬
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61K48/00;A61K31/7088;A61P35/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務(wù)所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

本發(fā)明公開了一種ZNF667蛋白的短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒及其應(yīng)用方法。首次成功構(gòu)建了ZNF667蛋白的短發(fā)夾RNA(ZNF667?shRNA)干擾質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至肝癌細胞株HepG2中，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNF667?shRNA質(zhì)粒的細胞株。發(fā)現(xiàn)削減HepG2細胞中的ZNF667蛋白可以抑制HepG2細胞的增殖，浸潤，侵襲遷移。裸鼠成瘤實驗證實，削減HepG2細胞中ZNF667的表達可以從在體水平抑制成瘤。削減HepG2細胞中的ZNF667蛋白的表達，可能是通過促進P53,抑制Bcl?2蛋白來達到抑制HepG2細胞的惡性程度。本發(fā)明將為肝癌的治療提供新線索和途徑，具有重大意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ZNF667蛋白的短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

ZNF667是在大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的一種表達上調(diào)的基因，通過與基因庫的比對發(fā)現(xiàn)沒有與之對應(yīng)的序列，它是一個全新的基因，將其命名為ZNF667，Genbank登錄號為 AY221750。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與之對應(yīng)的蛋白是一種KRAB型鋅指蛋白，含有14個鋅指結(jié)構(gòu)，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。

ZNF667的ORF為1827bp，編碼608個氨基酸。目前對于ZNF667相關(guān)功能研究結(jié)果如下：(1)ZNF667是一種新發(fā)現(xiàn)的KRAB型鋅指蛋白，能抑制SRE和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，具有轉(zhuǎn)錄抑制作用；(2)ZNF667定位在細胞核內(nèi)，主要在心臟和腦組織中表達，在肝、腎、骨骼肌、睪丸中表達次之，在其他組織表達則較少；(3)ZNF667基因在缺血、缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激條件下表達增多，具有典型的應(yīng)激反應(yīng)性；(4)ZNF667在應(yīng)激狀態(tài)下促進細胞生長；(5)ZNF667具有抗心肌細胞凋亡作用，H₂O₂處理H₉C₂心肌細胞在瞬時轉(zhuǎn)染ZNF667后能明顯的抑制Fas等蛋白的表達，且這種抗凋亡作用與直接和Fas啟動子結(jié)合而抑制其表達有關(guān)；ZNF667能抑制TNF-ɑ所致的細胞凋亡，且這種抗凋亡作用也與直接和Bid啟動子結(jié)合而抑制其表達有關(guān)。(6)ZNF667過表達后可以通過抑制Bax和P53的表達。有關(guān)ZNF667 的功能學(xué)研究表明：腦星形細胞瘤病理級別的升高，ZNF667mRNA及蛋白的含量呈上升趨勢，尤其是在惡性程度高的Ⅲ、Ⅳ級腦星形細胞瘤中，含量明顯升高。但是ZNF667在其他癌中的表達，運用ZNF667短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒對癌癥進行治療，尚沒有任何研究。

本發(fā)明通過使用ZNF667發(fā)夾干擾RNA(shRNA)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細胞系,建立ZNF667穩(wěn)定削減的肝癌細胞系，通過研究發(fā)現(xiàn)，HepG2-ZNF667-shRNA細胞系表現(xiàn)為細胞增殖減慢，克隆形成率減低，浸潤與侵襲能力下降。裸鼠成瘤實驗證實，抑制HepG2細胞中ZNF667的表達，可以從在體水平抑制HepG2細胞成瘤。本發(fā)明從細胞功能學(xué)水平和在體動物實驗水平證實了削減HepG2肝癌細胞中的ZNF667蛋白的表達，可以抑制HepG2細胞的惡性度，起到治療作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是通過構(gòu)建一種ZNF667蛋白的發(fā)夾短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒，探討削減ZNF667 蛋白對HepG2細胞的生物學(xué)特性的影響，進而將這種質(zhì)粒用于抑制肝癌的治療。

一種ZNF667蛋白的短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒，根據(jù)ZNF667的序列設(shè)計能夠產(chǎn)生干擾ZNF667 蛋白表達的siRNA的DNA片段，插入到短發(fā)夾RNA干擾載體中構(gòu)建而成。

上述質(zhì)粒以人ZNF667的mRNA序列為模板，以及載體啟動子啟動表達siRNA對序列的要求，設(shè)計合成能夠產(chǎn)生干擾ZNF667蛋白表達的siRNA的DNA片段。

siRNA干擾的目標基因ZNF667序列如下：

siRNA-1：CGAATATCTCTCACACGACAT；

siRNA-2：CGCCAATCATTTCTTATTGAA；