[發(fā)明專利]一種聯(lián)產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸的重組光滑球擬酵母

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611112770.0
• 申請(qǐng)日: 2016-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN106635852B
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周景文;陳堅(jiān);羅正山;堵國(guó)成;劉松;方芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12P7/40;C12P7/50;C12R1/645
• 代理公司: 23211 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 彭素琴<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明公開了一種聯(lián)產(chǎn)丙酮酸和α?酮戊二酸的重組光滑球擬酵母，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。通過(guò)基因工程技術(shù)，將來(lái)源于釀酒酵母的CDC19整合到pY26?TEF?GPD表達(dá)載體上，構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pY26?CDC19，并將其電轉(zhuǎn)進(jìn)受體菌TgU?中獲得一株高產(chǎn)丙酮酸的工程菌株TgU^?(pY26?CDC19)，相對(duì)于對(duì)照菌，總酸產(chǎn)量(丙酮酸和α?酮戊二酸)、總酸轉(zhuǎn)化率和總酸生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了112.2％、115.6％和155.6％，最重要的是重組菌TgU^?(pY26?CDC19)的α?酮戊二酸產(chǎn)量從其改造之前的0g/L增加到了30.1g/L。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種聯(lián)產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸的重組光滑球擬酵母，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

酮酸是分子中同時(shí)含有羧基和酮基的化合物。根據(jù)分子中羧基和酮基的相對(duì)位置可分為α、β-酮酸，它們是一類在生物體內(nèi)擁有重要作用的有機(jī)酸，同時(shí)目前社會(huì)對(duì)其需求量也不斷在增加，其廣泛應(yīng)用于日化，食品，醫(yī)療，農(nóng)業(yè)等行業(yè)。其中α酮酸是羧基在α碳原子上的的酮酸，丙酮酸是最簡(jiǎn)單的α酮酸。丙酮酸作為生物代謝的中間產(chǎn)物，處于各代謝途徑的中間環(huán)節(jié)，是糖酵解的終產(chǎn)物；通過(guò)脫氫脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為TCA循環(huán)的起始物質(zhì)乙酰-CoA；在丙酮酸羧化酶作用下生成TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物草酰乙酸；通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用生成丙氨酸等。同樣，α-酮戊二酸作為例外一種重要的酮酸，是細(xì)胞內(nèi)氮代謝的主要調(diào)控者。α-酮戊二酸作為谷氨酸的前體，與脯氨酸、精氨酸、鳥氨酸、多巴胺的分泌緊密相關(guān)，能有效維持胞內(nèi)的“谷氨酸池”(glutamine pools)，并在中間代謝過(guò)程中決定著氮代謝流走向合成或者分解，有效的維持體內(nèi)氮代謝平衡。α-酮戊二酸還與蛋白質(zhì)、脂類、維生素合成以及能量代謝緊密相關(guān)。

目前對(duì)其上述兩種重要的酮酸的生產(chǎn)主要是化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩大類。其中微生物發(fā)酵法相對(duì)于其化學(xué)合成有更多的優(yōu)點(diǎn)，如原料的轉(zhuǎn)化率高、污染小、成本低等優(yōu)點(diǎn)。但其兩種酮酸的微生物發(fā)酵采用的是獨(dú)立的發(fā)酵操作。由于微生物合成目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，不可避免的存在副產(chǎn)物的積累，而兩種酮酸在生物體的轉(zhuǎn)化是極其容易，因而其單獨(dú)發(fā)酵生產(chǎn)其中的某一種酮酸時(shí)，不可避免的要消除例外一種酮酸的存在，但是消除副產(chǎn)物的努力通常會(huì)顯著降低轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度，從而影響整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性。

如何將其兩種酮酸在一種微生物中進(jìn)行聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵，將對(duì)整個(gè)酮酸工業(yè)的發(fā)展有這重要的作用。聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)作為一種高效、經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵技術(shù)成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱門。通過(guò)微生物聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵獲得高產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸，其最關(guān)鍵是要有一株高產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸的菌株。目前其兩種酮酸的聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)在高產(chǎn)丙酮酸的光滑球擬酵母菌株中過(guò)量表達(dá)丙酮酸激酶，加強(qiáng)丙酮酸和α-酮戊二酸合成的共同合成途徑，從而對(duì)其兩種酮酸進(jìn)行高效率聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種聯(lián)產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸的重組菌，所述重組菌是以光滑球擬酵母為宿主，以pY26-TEF-GPD為載體，過(guò)表達(dá)丙酮酸激酶CDC19基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述CDC19基因是NCBI上Gene ID為851193的CDC19基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組菌是以缺失了URA3基因的光滑球擬酵母T.glabrata CCTCC M202019為宿主，表達(dá)NCBI上Gene ID:851193的CDC19。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述CDC19基因是以釀酒酵母菌株S288c基因組為模板擴(kuò)增得到的。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述重組菌的構(gòu)建方法，是以缺失了URA3基因的光滑球擬酵母T.glabrata CCTCC M202019為宿主，以pY26-TEF-GPD為載體，表達(dá)NCBI上Gene ID為851193的CDC19基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組菌按如下方法構(gòu)建：