[發明專利]一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法

有效

• 申請號: 201611112221.3
• 申請日: 2016-12-07
• 公開（公告）號: CN106755036B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 陳廷濤;辛洪波;王鑫
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74;C12N15/66;C12N15/62;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 劉華

本發明提供了一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，該技術方案依托于一種特異性識別TEM1蛋白的單鏈抗體，結合減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009的腫瘤內特異性聚集及胞內侵襲的特性，攜帶細胞凋亡誘導因子Aif達到特異性殺傷腫瘤的效果。具體來看，本發明首先構建了Abvec?Igk?Aif、Abvec?Igk?T18?Aif重組質粒，經擴增后通過電擊轉化的方式導入鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，利用減毒鼠傷寒沙門氏菌胞內侵襲的特性，以HEK293?T細胞為宿主實現蛋白的表達，最后利用含青霉素、鏈霉素的血清培養基殺死細胞內外的減毒鼠傷寒沙門氏菌，使重組質粒釋放至真核細胞中，經細胞破碎后即得到含有目的蛋白的上清液，該上清液即屬于本發明所述藥物的一種存在形式。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，進一涉及基因重組與轉染方法的研究，同時涉及目的蛋白的表達及其功能驗證，具體涉及一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法。

背景技術

細胞凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)，是一類存在于線粒體內外膜之間的保守的黃素蛋白，可誘導Caspase非依賴性細胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26，其轉錄產生的mRNA的長度為2.4kb，編碼產生的蛋白質有三個不同長度的可變剪接體，它們的氨基酸數分別為613、609和326。除可誘導細胞凋亡外，AIF兼具氧化還原酶的活性。

當細胞受到特定的凋亡誘導信號的刺激后，線粒體膜上的通透性孔道(mitochondrial permeability transition pores，MPTP)打開，允許AIF從線粒體釋放到胞漿，并進入細胞核中，和另一個線粒體蛋白endonuclease G(Endo G)一起，引起核內DNA凝集并斷裂成50kb大小的片段

在介導細胞凋亡過程時，AIF有兩個方面的作用：一是可以作為細胞凋亡的起始因子，二是可以作為細胞凋亡的直接效應因子。在正常的情況下，AIF存在于線粒體中，可以清除細胞內的自由基從而阻止細胞凋亡；當細胞受到凋亡刺激后。AIF首先從線粒體出來，然后轉移至細胞質中，最后轉移到細胞核中發揮促進細胞凋亡的作用。

內皮唾液酸蛋白(TEM1/CD248)是Ⅰ型跨膜蛋白，由一個被糖基化修飾的80.9KDa的蛋白核心區組成，修飾后成熟的糖蛋白大約在175KDa。TEM1是近期發現的人類腫瘤標記物之一，其對腫瘤的細胞生長血管生成浸潤及轉移有重要作用。

TEM1外部分由五個球狀結構域(N端的C型凝集素結構域，壽司樣結構域，和三個表皮生長因子(EGF)樣重復)和一個粘蛋白樣區組成，其中核心蛋白大量唾液酸化與血栓調節蛋白相似。對于成體組織，TEM1的表達分布是這樣的：子宮腎小球輸卵管血管心和肺其他組織；另外，在內皮祖細胞中TEM1表達量相對很少。然而，在以下腫瘤中TEM1都有高表達，如肉瘤，腦腫瘤，乳腺癌，皮膚癌、結腸癌，且實驗表明在卵巢癌中，TEM1表達與腫瘤的浸潤、預后密切相關。因此，TEM1在正常組織不表達或者低表達，而在腫瘤血管組織高表達的特點，預示了TEM1作為腫瘤診斷和治療的靶標分子的潛力。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，以解決現有技術中天然結構的細胞凋亡誘導因子AIF對腫瘤細胞的攻擊缺乏靶向作用。

本發明要解決的另一技術問題是現有技術中缺乏一種AIF與抗體偶聯的靶向抗腫瘤藥物。

本發明要解決的再一技術問題是在獲得了整合有AIF-單鏈抗體復合物的表達基因的重組質粒的情況下，現有技術中對此類質粒的表達方法操作繁瑣、蛋白表達水平較低。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：