[發(fā)明專利]一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611112221.3
• 申請日: 2016-12-07
• 公開（公告）號: CN106755036B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳廷濤;辛洪波;王鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74;C12N15/66;C12N15/62;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 劉華

1.一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表達(dá)基因，通過酶切方式與Abvec-Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif；

2)取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif，在宿主細(xì)胞E.coli Top10中進行質(zhì)粒擴增；

3)收集步驟2)擴增后的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif，通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株中，即得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009；所述電轉(zhuǎn)法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25μ F的條件電轉(zhuǎn)4.7ms；

4)取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80～1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合，混合后培養(yǎng)4～16h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細(xì)胞收集上清。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于步驟1)所述酶切方式是經(jīng)AgeI和BsiwI雙酶切，對酶切產(chǎn)物純化后，采用T4連接酶連接到Abvec-Igk質(zhì)粒中。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于步驟3)所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，是通過以下方法制備的：

A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；

B)挑取單菌落接種于3～7mlLB液體培養(yǎng)基中，35～39℃振蕩培養(yǎng)10～14h；

C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80～1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值不小于0.4；

D)冰浴15～25min后，離心取沉淀用1/8～1/12體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％mL/mL濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％mL/mL的甘油中。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于HEK293-T細(xì)胞的加入量為8000～12000個/孔；HEK293-T細(xì)胞與載體菌株在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380～420μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。