[發(fā)明專利]修飾肽的展示

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611109795.5
• 申請日: 2011-07-29
• 公開（公告）號(hào): CN107058285A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: G·克里斯蒂安森
• 申請（專利權(quán)）人: 米蒂生物系統(tǒng)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司44205
• 代理人: 江側(cè)燕

本申請是申請?zhí)枮?011800454742、申請日為2011年07月29日、名稱為“修飾肽的展示”的發(fā)明專利申請的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種展示翻譯后修飾肽的展示系統(tǒng)。

背景技術(shù)

在許多情況下，人們利用大型化合物庫來篩選和鑒定具有所需活性或特性的化合物，從而尋找新的化合物。組合肽庫技術(shù)是發(fā)現(xiàn)和研制藥物的寶貴資源。人們已經(jīng)證明，在這種篩選中，采用在噬菌體或其它病毒顆粒上展示重組肽庫尤其有用。為了探索人類許多疾病新的治療方法，許多研究團(tuán)體正在努力從肽庫開發(fā)具有生物活性的肽。

噬菌體展示肽庫技術(shù)已經(jīng)在探索許多人類疾病新的治療方法中得到了廣泛的應(yīng)用。在絲狀噬菌體上展示的肽庫已經(jīng)作為一種篩選資源，用于鑒定與任何給定靶結(jié)合，從而顯示有藥理效用的肽。隨后，可以采用傳統(tǒng)合成化學(xué)方法大量合成出如此鑒定出來的肽。

噬菌體M13是絲狀噬菌體科的一種帶單鏈(ss)DNA基因組的無包膜絲狀大腸桿菌噬菌體。核衣殼由具有不同拷貝數(shù)的四種噬菌體蛋白組成：pVIII的拷貝數(shù)是大約2700，而pIII、pVI和pIX的拷貝數(shù)是5。除T4、T7、fd和λ(lambda)等之外，M13噬菌體也已經(jīng)成功用于噬菌體展示，在生物技術(shù)篩選方法中得到應(yīng)用。在這種篩選方法中，將隨機(jī)肽庫在噬菌體M13的核衣殼表面上展示，以研究不同噬菌體與結(jié)合配體(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA等)的相互作用。通常，合成寡核苷酸被克隆到核衣殼蛋白的編碼基因內(nèi)，從而，將人們感興趣的肽(或不同肽的庫)在噬菌體M13核衣殼的表面上展示，用于后續(xù)的結(jié)合研究。

噬菌體展示方法通常涉及到將隨機(jī)寡核苷酸插入到噬菌體基因組內(nèi)，這樣，它們可以引導(dǎo)細(xì)菌宿主表達(dá)與噬菌體外殼蛋白融合的肽庫(如絲狀噬菌體pIII、pVI或pVIII)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以在較小的噬菌體中，處理包含高達(dá)1015個(gè)不同個(gè)體的庫，以及展示肽與編碼其的遺傳信息的物理連鎖也是這種技術(shù)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。

基礎(chǔ)噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)擴(kuò)展到包括從可復(fù)制基因包(如真核病毒、細(xì)菌及酵母細(xì)胞)展示而不是噬菌體展示的肽庫?？蓮?fù)制基因包展示技術(shù)的原理和戰(zhàn)略與噬菌體非常相似，也就是說，將核酸編碼的展示肽插入到可復(fù)制基因包的基因組內(nèi)，在待篩選肽和暴露在細(xì)胞或病毒表面的內(nèi)源性蛋白之間產(chǎn)生融合蛋白。融合蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，使得肽在細(xì)胞或病毒表面得到展示。

某些團(tuán)體試圖通過肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)增加庫的多樣性，通過化學(xué)反應(yīng)得到了構(gòu)象限制的肽。

EP1187914B1公開了一種結(jié)構(gòu)限制的肽庫，包括利用半胱氨酸殘基之間的二硫鍵穩(wěn)定的多個(gè)環(huán)肽。

WO2009/098450A2公開了一種噬菌體顆粒，展示了經(jīng)連接化合物連接的二硫化物穩(wěn)定的雙環(huán)肽。

US2009/0137424A1公開了展示多肽的噬菌體的翻譯后修飾，所述多肽包含非天然氨基酸，為疊氮-炔烴[3+2]環(huán)加成反應(yīng)和施陶丁格(Staudinger)修飾提供靶。

EP2048155A1描述了縮酚酸肽天然化合物的生物合成。采用類ATP-grasp酶對5-50個(gè)氨基酸之間的前體肽序列進(jìn)行修飾。例如，在大腸桿菌中引入核酸分子，得到縮酚酸肽天然化合物，如Microviridin。

Oman等人(Nature Chemical Biology 6:9-18(2010))對幾種核糖體肽的天然產(chǎn)品合成進(jìn)行了綜述。前體肽由前導(dǎo)肽進(jìn)行翻譯后加工得到的。這些前導(dǎo)肽幫助折疊前體肽，穩(wěn)定前體肽防止其降解，并在宿主內(nèi)部生物合成期間，保持前體在分泌和蛋白質(zhì)水解的合適時(shí)間之前沒有活性。

人們迫切需要利用肽庫技術(shù)開發(fā)新的靶向肽。因此，本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的篩選用結(jié)構(gòu)限制的肽庫。

發(fā)明內(nèi)容

通過提供具有權(quán)利要求所述特點(diǎn)的實(shí)施例，得到解決這種技術(shù)問題的方案。于是，本發(fā)明通過翻譯后修飾(PTM)酶的酶促加工，很容易建立大型的多環(huán)肽庫。

本發(fā)明提供了一種展示肽的可復(fù)制基因包，所述肽在氨基酸側(cè)鏈的兩個(gè)雜原子之間具有至少一個(gè)分子內(nèi)環(huán)鍵，包括分子內(nèi)異肽鍵、酯鍵或羊毛硫氨酸鍵。

本發(fā)明所述的可復(fù)制基因包優(yōu)選選自由噬菌體顆粒、細(xì)菌、酵母、真菌、微生物孢子和核糖體組成的組。

特別地，所述可復(fù)制基因包選自由M13噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體、fd噬菌體和λ噬菌體組成的組。

根據(jù)本發(fā)明具體的一個(gè)方面，所述肽是包含前導(dǎo)肽和核心肽的前體肽。

所述前導(dǎo)肽優(yōu)選包括天然核糖體肽的前導(dǎo)肽。