[發明專利]一種馬來酸順反異構酶的熱穩定性改造及其應用

有效

• 申請號: 201611108889.0
• 申請日: 2016-12-06
• 公開（公告）號: CN106636052B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 周哲敏;余龍;周麗;崔文璟;劉中美;郭軍玲;張斌
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/46;C12P13/20;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明公開了一種馬來酸順反異構酶的熱穩定性改造及其應用，屬于酶工程領域。本發明將來源于粘質沙雷氏菌的馬來酸順反異構酶基因maiA通過半理性設計的方法進行了熱穩定改造，得到的突變體與野生型的馬來酸順反異構酶相比，突變體G27A?G171A在55℃的半衰期是野生型的2.9倍，酶活是野生型的1.96倍；突變體G27A?K104R在55℃的半衰期是野生型的4.18倍，酶活是野生型的1.59倍。

技術領域

本發明涉及一種馬來酸順反異構酶的熱穩定性改造及其應用，屬于酶工程領域。

背景技術

馬來酸順反異構酶催化馬來酸轉化為富馬酸，而富馬酸又可以經過天冬氨酸酶轉化為附加值更高的天冬氨酸或經過富馬酸酶轉化為蘋果酸，要想實現從馬來酸向天冬氨酸或蘋果酸的直接轉化而省去中間產物富馬酸的分離純化，就需要將馬來酸順反異構酶與天冬氨酸酶或富馬酸酶耦聯起來使用。而不管是天冬氨酸酶還是富馬酸酶其熱穩定性都要高于馬來酸順反異構酶，要想實現這個耦聯催化體系的可連續性和重復使用性，就要求馬來酸順反異構酶有較好的活性和熱穩定性。粘質沙雷氏菌來源的馬來酸順反異構酶是現有報道中活性最高的馬來酸順反異構酶，而所有菌株來源的馬來酸順反異構酶的熱穩定性都較差。

目前關于提高馬來酸順反異構酶熱穩定性的研究還很少。酶活性中心的改造往往會造成酶活性的下降或喪失。

發明內容

本發明首先提供了馬來酸順反異構酶突變體，是將如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的第27位甘氨酸突變為丙氨酸并將第171位甘氨酸突變為丙氨酸；或者將第27位甘氨酸突變為丙氨酸并將第104位賴氨酸突變為精氨酸；或者第27位甘氨酸突變為丙氨酸；或者第104位賴氨酸突變為精氨酸；或者將第171位甘氨酸突變為丙氨酸。

本發明還提供了一種表達所述馬來酸順反異構酶突變體的重組菌，是以pET-24a(+)為表達載體，將編碼突變體的基因與表達載體連接后，轉化宿主大腸桿菌BL21(DE3)。

本發明選取馬來酸順反異構酶的酶分子表面非保守的Gly或Lys，分別突變成Ala或Arg，獲得了熱穩定性和酶活性提高了的MaiA突變酶，然后將這些點進行組合突變，獲得效果更好的突變體。其中，突變體G27A-G171A在55℃的半衰期是野生型的2.9倍，酶活是野生型的1.96倍；突變體G27A-K104R在55℃的半衰期是野生型的4.18倍，酶活是野生型的1.59倍。本發明提供的馬來酸順反異構酶突變體及相應的重組菌，將在富馬酸、天冬氨酸或蘋果酸的生產中，發揮更好的作用。

附圖說明

圖1pET-24a(+)-maiA定點突變全質粒PCR結果；M：DNA marker；1：pET-24a(+)-maiA定點突變全質粒PCR結果

圖2馬來酸順反異構酶的純化結果；M：protein marker；1：重組菌粗酶液；2：純化后的馬來酸順反異構酶

圖3野生型和突變體的初始相對酶活和在55℃下的半衰期；(A)單突變體的相對酶活：(B)單突變體55℃半衰期；(C)組合突變體的相對酶活；(D)組合突變體55℃半衰期

圖4突變體熱穩定性比較

具體實施方式

酶活的測定方法：

反應體系為50μL 1.5mg/mL的純化后的馬來酸順反異構酶加100μL 1mol/L的馬來酸鉀溶液再加350μL的pH8.0的磷酸鹽緩沖液組成的500μL的反應體系。在40℃反應10min，然后迅速在100℃煮沸10min，離心取上清液稀釋50倍，測定生成的富馬酸含量。

底物馬來酸和產物富馬酸互為異構體，用高效液相色譜發(HPLC)進行測定：