[發明專利]多交叉擴增結合金納米生物傳感檢測副溶血性弧菌的方法

有效

• 申請號: 201611105333.6
• 申請日: 2016-12-05
• 公開（公告）號: CN106755358B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 葉長蕓;王毅;王艷
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;C12Q1/689;C12N15/11
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

本發明公開了一種多交叉擴增結合金納米生物傳感檢測副溶血性弧菌的方法，所述方法在多交叉置換擴增中的交叉引物CP1或CP2的5’端標記生物素，在擴增引物C1或C2的5’端標記半抗原，所述方法針對副溶血性弧菌toxR基因的擴增產物能被金納米生物傳感器可視化檢測。所述方法便捷、快速、敏感、特異，適宜于各種核苷酸片段檢測。

技術領域

本發明公開了一種副溶血性弧菌的檢測方法，屬于微生物學領域。

背景技術

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種呈絲狀，弧狀或桿狀的革蘭氏陰性菌，無芽孢形成。該病原體是重要的食源性疾病病原體，是廣泛存在于河口、沿海及海洋環境中的嗜鹽菌。副溶血性弧菌常分離自海產品及臨床標本，引起海產品源性的腸熱癥，臨床癥狀表現為發熱、腹瀉。據WHO數據統計，副溶血性弧菌被認為是引起海產品源性疾病最主要的因素。副溶血性弧菌食物中毒，是進食含有該菌的食物所致，主要來自海產品，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力強，在抹布和砧板上能生存1個月以上，海水中可存活47天。全球每年有7萬病人死于海產品源性腹瀉，而絕大多數海產品源性的腹瀉病例是副溶血性弧菌導致，從而受到世界各國的高度關注，成為各國的重大公共衛生問題。因此，為了給予臨床病人準確快速的治療，開展海產品監測以及副溶血性弧菌的流行病學調查，研發一個省時、省力和特異性較高的檢測方法，能夠同時檢測和鑒定副溶血性弧菌成為必要。

目前對于副溶血性弧菌的檢測主要依賴于傳統的增菌培養和生化鑒定。該方法耗時大約5到7天，包括增菌、選擇培養及后續的生化鑒定，其劣勢是耗時耗力，生化結果的判讀依賴于人的主觀判斷，導致結果重復性差，易錯判。隨著核酸診斷技術的快速發展，一些以PCR為基礎的診斷技術(如普通PCR技術，熒光PCR技術)被用于副溶血性弧菌的快速檢測，然而這些方法依賴于昂貴的儀器設備，需要后續的電泳操作，昂貴的探針合成，以及熟練的操作人員。對于一些落后的實驗室無法進行，限制了這些技術的運用。目前運用這些檢測技術診斷副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的PCR方法和Real-time PCR方法，檢測靈敏度差，檢測過程耗時較長，不利于快速檢測和應急檢測。

為了克服PCR擴增技術的劣勢，近年來發展了許多恒溫擴增技術。恒溫擴增技術較PCR技術而言，不依賴于熱循環擴增設備，反應速度快，敏感性好。因此，恒溫擴增技術有利于實現快速擴增，便捷檢測及現場診斷。到目前為止，已發展的恒溫擴增技術有10余種，應用較為廣泛的有滾環擴增(RCA)、鏈置換擴增(SDA)、解旋酶依賴的恒溫擴增(HDA)、環介導恒溫擴增(LAMP)、交叉擴增(CPA)等。然而，這些恒溫技術實現核酸擴增需要多種酶同時工作，依賴于昂貴的試劑，復雜的操作步驟。因此這些方法的實用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速診斷領域及欠發達地區。為了克服PCR技術及現有恒溫擴增技術的劣勢，實現便捷、快速、敏感及特異的擴增核酸序列，在生物、農業、醫學等領域，發明人近期已經建立了一種新的核酸擴增技術，命名為多交叉置換擴增(Multiple Cross DisplacementAmplification，MCDA)，相關內容公開于CN104946744A，該專利文件作為現有技術文件構成本申請說明書的一個部分。

MCDA在恒溫條件下實現核酸擴增，僅使用一種恒溫置換酶、擴增速度快、反應靈敏、特異性高。為了使該技術在生物、醫藥及衛生領域應用更廣泛、更經濟。近期，發明人以MCDA為基礎，將MCDA技術與納米生物檢測技術相結合，開發了依賴MCDA技術，實現快速、敏感檢測的納米生物傳感技術，該技術被命名為多交叉恒溫擴增結合金納米生物傳感的核酸診斷技術(Multiple Cross Displacement Amplification label-based goldNanoparticles Lateral Flow Biosensor,MCDA-LFB)，相關內容已申請于CN201610872509.4、CN201610942289.8、CN201610982015.1。